合成的跨膜DNA受体使工程传感和驱动成为可能

合成复制跨膜蛋白信号转导是合成生物学的一个重要目标。在这里，作者展示了合成的跨膜DNA受体的二聚化如何用于设计响应外部分子信号的传感和驱动级联。

　　

合成跨膜 DNA 受体：细胞信号转导研究的新突破

华东理工大学先进材料重点实验室等多单位的研究人员 Ze - Rui Zhou、Man - Sha Wu 等，在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Synthetic transmembrane DNA receptors enable engineered sensing and actuation” 的论文。该研究构建了基于合成跨膜 DNA 受体的人工跨膜信号转导系统，为实现定制化的细胞调控和复杂生物功能提供了新策略，在生物医学领域具有潜在应用价值，有望推动个性化医疗等方面的发展。

一、研究背景

信号转导是活细胞的重要特征，它使细胞能够感知并响应外部环境变化，实现细胞间的通讯。在自然系统中，信号转导主要依赖跨膜蛋白受体，当受体与配体相互作用时，会引发跨膜受体的构象变化，进而激活一系列下游级联反应途径。受自然受体的启发，研究人员致力于开发工程合成受体，以实现复杂的定制化感知和响应功能。合成受体的结构可更轻松地进行定制或修饰，以适应不同的情况和目的。理想情况下，合成受体能够通过化学编码对不同输入信号做出反应，触发受体状态改变，并诱导级联反应，引发细胞状态的下游变化。此外，合成受体需能够轻松嵌入活细胞膜且不影响细胞活力。

近年来，在构建各种合成跨膜受体以执行基于识别的跨膜传感和驱动方面取得了诸多进展。研究人员受天然受体启发，专注于创建各种功能性分子作为受体，包括有机聚合物、主客体超分子、分子马达 / 开关、蛋白质 - 适体对和基于 DNA 的支架等。其中，DNA 支架因其独特优势备受关注。高通量 SELEX 技术的改进加速了高亲和力 DNA 适体的筛选，推动了基于 DNA 纳米结构的受体设计，如 DNA 纳米笼、DNA 纳米管、DNA 多面体和 DNA 折纸等，这些创新使 DNA 支架在传感器和药物递送系统中展现出更高的灵敏度和特异性。同时，DNA 支架与纳米医学和合成生物学的结合，拓展了其在实时成像、靶向治疗和生物传感等领域的应用前景。然而，开发更智能、生物相容性更好且可定制的感知和响应受体仍面临挑战，包括合成受体在活细胞膜上的快速稳定锚定、受体与细胞环境输入信息识别时的合适构象变化工程，以及下游级联事件与新兴细胞功能调节之间的耦合等。

二、研究材料与方法

（一）材料

研究使用的细胞系，如 HeLa、T47d、HepG2、MDA - MB - 453 和 T 细胞，购自 bluefbio（上海）生物技术发展有限公司。多种试剂，包括 Lipo 2000、DNase I、Annexin - v FITC/PI、Cell Counting Kit8（CCK - 8）、金属氯化物、DNA 标记物、胆固醇、多种脂质单体以及各类抗体等，分别购自不同公司。所有 DNA 链由 Sangon Biotech（上海）合成并纯化，实验中使用的溶液均由 Millipore Milli - Q 水纯化系统制备的超纯水配制。

（二）方法

1. 制备 DNA 整合脂质体囊泡：将胆固醇、1,2 - 二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、1,2 - 二油酰 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸胆碱脂质单体（DOPC）、1,2 - 二油酰 - 3 - 三甲基铵丙烷（DOTAP）按特定摩尔比溶解在氯仿中，通过薄膜水化法制备脂质体。然后将跨膜 DNA 链与脂质混合物在 37°C 孵育 4 小时，再通过 200nm 聚碳酸酯膜挤出形成 DNA 整合脂质体囊泡。

2. 制备 H - Mn 链封装脂质体：将 H - Mn 链与无血清培养基混合，同时将 Lipo - 2000 溶解在无血清培养基中孵育，之后混合两种溶液并在室温下孵育 30 分钟，得到 H - Mn 链封装脂质体。

3. 凝胶电泳分析：采用琼脂糖凝胶电泳（AGE）在 1×TBE 缓冲液中于 75V 电泳 45 分钟，研究合成跨膜 DNA 受体的组装情况。样品在电泳前需与 6x 上样缓冲液混合，凝胶经 Super GelRed 染色后在蓝光下成像。

4. 细胞培养：HeLa、HepG2 和 T47d 细胞在添加特定成分的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% O?气氛下培养。CD8 + T 细胞在 CD8 + T 细胞完全培养基中培养，使用胰蛋白酶消化细胞。

5. DNA 修饰在细胞膜上：通过 DNA 整合囊泡 - 细胞融合过程，将癌细胞与 DNA 整合脂质体囊泡在室温下孵育 2 小时，然后用 PBS 缓冲液洗涤，以实现 DNA 在细胞膜上的修饰，并通过 DNase I 处理定量细胞膜外表面的 DNA。

6. 荧光测量：使用 Agilent 荧光光谱仪在特定激发波长下测量 DNA 链的荧光光谱。

7. 共聚焦激光扫描显微镜成像：利用 Nikon A1 共聚焦荧光显微镜及 ×60 油镜进行成像，设置不同的收集波长范围检测不同荧光通道。

8. 选择性癌细胞杀伤实验：设计实验利用不同癌细胞表面的 MUC 1 和 Met 标记，评估 AND/OR 逻辑 DNAzyme - 基于动态级联信号转导（DCST）的选择性细胞杀伤效果。通过共聚焦荧光成像、Annexin V/PI 染色和蛋白质免疫印迹等方法评估该过程的有效性。

9. 细胞毒性测量：使用 10% CCK - 8 在 Synergy 2 多功能微孔板读数仪上测量细胞毒性，通过收集 450nm 处的吸光度评估癌细胞的杀伤效果。

三、研究技术路线

研究人员设计了由细胞外信号接收部分、亲脂性跨膜锚定部分和细胞内信号输出部分组成的合成跨膜 DNA 受体。首先，设计两条跨膜 DNA 链（Seq1 和 Seq2）构建信号输出系统，验证其在细胞表面形成二聚体并诱导下游信号输出的可行性。接着，开发适体锁定设计规则，通过设计 AND 逻辑响应性 DNA 受体（A - Seq1 和 A - Seq2）和 OR 逻辑响应性 DNA 受体（O - Seq1 和 O - Seq2），调整细胞外信号接收部分，实现对信号输入的精细控制。然后，将逻辑门响应性 DNA 受体的成功操作应用于更复杂的细胞活动调节，设计基于 DNAzyme 的动态级联信号转导系统（AND 逻辑 DCST 和 OR 逻辑 DCST），实现对细胞间通讯、基因转录、蛋白质表达和细胞凋亡等细胞功能的调控。最后，应用 DCST 治疗癌细胞，通过体外划痕实验和 T 细胞介导的癌细胞杀伤实验评估其治疗效果。

四、研究结果

（一）合成跨膜 DNA 受体用于信号转导的开发

设计的 Seq1 和 Seq2 跨膜 DNA 链包含信号识别的细胞外部分、膜锚定的疏水 C12 间隔区和下游信号输出的细胞内部分。将 DNA 链与脂质溶液混合制备 DNA 整合脂质体囊泡（lipo - Seq1 和 lipo - Seq2），其可通过囊泡 - 细胞融合过程将整合的 DNA 转运到细胞膜上。实验表明，修饰有 Seq1/Seq2 的细胞在孵育 12 小时后细胞膜上荧光分布稳定，证明合成 DNA 受体在生理条件下稳定性良好。

向 Seq1/Seq2 整合的 HeLa 细胞中递送发夹链（H - Mn），通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察到，在 lipo - Seq1 和 lipo - Seq2 处理后，HeLa 细胞表面出现明显的绿色和蓝色荧光信号，添加 Mn2?离子后出现红色荧光，表明 DNAzyme 激活并催化了 H - Mn 的切割。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析进一步证实了 Seq1 和 Seq2 的二聚化、底物杂交以及 DNAzyme 控制的底物切割等构型变化。这些结果表明成功构建了 DNA 介导的人工跨膜信号转导系统，该系统可实现信号识别和转导。

（二）逻辑门响应性 DNA 受体的设计

开发适体锁定设计规则，设计 AND 逻辑响应性 DNA 受体（A - Seq1 和 A - Seq2）和 OR 逻辑响应性 DNA 受体（O - Seq1 和 O - Seq2）。A - Seq1 和 A - Seq2 的细胞外部分分别为靶向 MUC 1 和 Met 的适体序列，O - Seq1 和 O - Seq2 的设计类似。通过 F?rster 共振能量转移（FRET）效应，适体的荧光被相应互补 DNA 链淬灭。

利用四种不同细胞系（HeLa、T47d、HepG2 和 MDA - MB - 453）对 AND 和 OR 逻辑门响应性 DNA 受体进行测试。CLSM 图像显示，HeLa 细胞在 AND 逻辑操作步骤 2 后表面出现明显蓝色和绿色荧光信号，T47d/HepG2 细胞仅出现蓝色或绿色荧光，MDA - MB - 453 细胞无荧光，证实了 AND 逻辑操作的成功实施；在 OR 逻辑操作中，HeLa、T47d 和 HepG2 细胞表面出现明显蓝色和绿色荧光信号，MDA - MB - 453 细胞无荧光，证实了 OR 逻辑操作的成功实施。PAGE 分析也证实了逻辑门响应性 DNA 受体的构型变化。这些结果建立了构建用于更复杂逻辑门计算的合成跨膜 DNA 受体的设计规则。

（三）基于 DNAzyme 的动态级联信号转导的设计

设计基于 AND 逻辑的 DNAzyme 动态级联信号转导（AND 逻辑 DCST，DA - Seq1 和 DA - Seq2）和基于 OR 逻辑的 DNAzyme 动态级联信号转导（OR 逻辑 DCST，DO - Seq1 和 DO - Seq2）系统。以 AND 逻辑 DCST 为例，其包含针对 MUC 1 和 Met 的选择性识别部分、用于二聚化的互补链、膜锚定部分、Mg2?依赖的 DNAzyme 和 Mn2?依赖的 DNAzyme。

在体外验证了 AND 逻辑 DCST 的成功设计后，使用四种不同细胞系进行测试。结果显示，AND 逻辑 DCST 可激活 HeLa 细胞（同时表达 MUC 1 和 Met）中的 T 细胞 / 癌细胞相互作用和 PD - L1 mRNA 抑制，而其他三种细胞系则不能被激活。CLSM 图像和平均荧光强度分析证实了该过程的成功实施，蛋白质免疫印迹结果表明 HeLa 细胞中 PD - L1 表达显著下调。OR 逻辑 DCST 的测试结果类似，可激活表达 MUC 1 或 Met 的癌细胞（HeLa、T47d 和 HepG2）中的 T 细胞 / 癌细胞相互作用和 PD - L1 mRNA 抑制，MDA - MB - 453 细胞无此现象。这些结果表明逻辑门响应性 DNA 受体的成功操作可进一步应用于实现对细胞活动的靶向调控。

（四）基于 DNAzyme 的动态级联信号转导（DCST）的治疗效果

将 DCST 应用于治疗癌细胞，通过体外划痕实验和 T 细胞介导的癌细胞杀伤实验评估其治疗效果。体外划痕实验中，AND 逻辑 DCST 处理后 HeLa 细胞的伤口愈合明显受阻，OR 逻辑 DCST 可抑制 HeLa、T47d 和 HepG2 细胞的伤口愈合，而 MDA - MB - 453 细胞不受影响，表明逻辑 DCST 策略可基于逻辑运算结果对癌细胞进行靶向杀伤。

在 T 细胞介导的癌细胞杀伤实验中，AND 逻辑 DCST 处理后，仅 HeLa 细胞出现明显的 Annexin - v - FITC 阳性和 PI 阳性信号，表明细胞发生凋亡；OR 逻辑 DCST 处理后，HeLa、HepG2 和 T47d 细胞均出现明显的凋亡信号。对照实验未显示如此明显的治疗效果，细胞活力实验排除了脂质体囊泡的毒性。这些结果表明基于 DNAzyme 的动态级联信号转导系统可成功实现靶向细胞分析和精确协同杀伤，证明了该系统在生物环境中操作的可行性，具有在疾病诊断和治疗中潜在应用的可能。

五、研究结论与讨论

本研究展示了 DNA 介导的人工跨膜信号转导系统可进行系统工程设计和驱动，用于定制化信号识别和转导。合成 DNA 受体由细胞外信号接收部分、亲脂性跨膜锚定部分和细胞内信号输出部分组成，在外部信号输入时，可在细胞表面形成二聚体，引发一系列下游级联事件。

研究人员首先证明了合成跨膜 DNA 受体在活细胞膜上的二聚化，接着开发适体锁定设计规则，实现了对逻辑门计算的更精细控制。逻辑门响应性 DNA 受体的成功操作进一步应用于更复杂的细胞活动调节，通过设计基于 DNAzyme 的动态级联信号转导系统，实现了协同癌细胞杀伤。该策略为其他用户定义的传感和驱动效应开辟了道路，广泛适用于实现复杂的生物功能。其特异性和多功能性使其非常适合在异质环境中识别和靶向特定细胞类型，这对个性化医学至关重要。未来研究将集中于扩展该策略在活生物体和临床环境中的多种应用，如非侵入性诊断和靶向治疗。

综上所述，该研究成果为细胞信号转导研究提供了新的思路和方法，有望推动生物医学领域的进一步发展，为疾病的诊断和治疗带来新的突破。