Wolframin、P - 糖蛋白与 GRP78/BiP 协同影响 L1210 细胞内质网应激反应及药物敏感性的深度探究

为探究 Wolframin、P - 糖蛋白（P-gp）和 GRP78/BiP 是否协同改变 L1210 细胞对内质网应激（ERS）的反应或药物敏感性，研究人员诱导细胞 ERS，检测相关基因和蛋白表达。结果发现 P-gp 阳性细胞中 Wolframin 表达增加且能形成蛋白复合物，这为肿瘤耐药研究提供新视角。

　　在肿瘤治疗领域，癌细胞的多药耐药（Multidrug resistance，MDR）现象一直是阻碍癌症化疗效果的重大难题。癌细胞对多种结构和作用机制不同的药物敏感性显著降低，使得化疗难以达到预期效果。其中，ABC 家族膜转运蛋白的过度表达，尤其是 P - 糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），是导致 MDR 的常见原因之一 。同时，内质网（Endoplasmic reticulum，ER）作为细胞内重要的细胞器，在维持细胞内稳态方面发挥着关键作用，如调节细胞内 Ca²⁺离子浓度、控制新生蛋白质的 N - 糖基化和正确折叠等。一旦这些过程失衡，就会引发内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）。

已有研究表明，ERS 相关过程可能会影响肿瘤细胞对药物的敏感性，且 P-gp 阳性的 L1210 细胞相较于 P-gp 阴性细胞，GRP78/BiP（78kDa 葡萄糖调节蛋白，也称为免疫球蛋白结合蛋白或热休克 70kDa 蛋白 5，Heat shock 70 kDa protein 5，Hspa5 基因编码产物）表达更高，同时其他 ERS 标记物的表达也发生了变化。此外，Wolframin（WFS1 基因产物）作为一种 ER 跨膜蛋白，其突变与 Wolfram 综合征相关，并且在 ERS 过程中常常过表达，可能参与调节细胞内 Ca²⁺稳态和蛋白质折叠。然而，Wolframin 与 P-gp、GRP78/BiP 之间在 ERS 及药物敏感性方面的关系尚不明确。

为了解开这些谜团，斯洛伐克科学院分子生理学和遗传学研究所等机构的研究人员开展了相关研究。他们的研究成果发表在《Cancer Cell International》上，为深入理解肿瘤细胞的耐药机制提供了重要线索。

研究人员采用了多种关键技术方法。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）技术检测相关基因的表达水平和蛋白含量；运用免疫细胞化学技术观察蛋白的定位和含量变化；利用免疫沉淀技术检测蛋白之间的相互作用。

研究结果如下：

1. Wfs1 基因表达：研究人员使用 RT-PCR 方法检测发现，S 细胞（药物敏感的小鼠淋巴母细胞系 L1210，不表达 P-gp）和 R 细胞（由 S 细胞经长春新碱筛选获得的 P-gp 阳性耐药细胞）在正常条件及 ERS 诱导后均存在 Wfs1 基因转录本。经测序验证，该 PCR 产物确实对应 Wfs1 基因。在转录水平上，Tun（衣霉素，一种 N - 糖基化阻断剂）显著诱导 S 和 R 细胞中 Wfs1 基因表达增加，Thap（毒胡萝卜素，可阻断 ER 钙泵）对 S 细胞中 Wfs1 基因表达的促进作用更强，S 细胞经 Thap 处理后 Wfs1 转录本含量显著高于 R 细胞。在蛋白水平上，R 细胞中 WFS1 含量高于 S 细胞，Tun 处理后这种差异更加明显，而 Thap 处理后 R 细胞中 WFS1 水平不变，S 细胞中 WFS1 水平显著增加 。
2. WFS1 的定位和含量：免疫细胞化学结果显示，R 细胞中 WFS1 含量高于 S 细胞，且 WFS1 与内质网标记蛋白 IP3R2（肌醇 1,4,5 - 三磷酸受体 2）和 SERCA2（肌浆 / 内质网钙 ATP 酶 2）共定位。进一步通过荧光强度分析发现，Tun 或 Thap 处理后，R 细胞中 WFS1 水平变化不显著，S 细胞中 Thap 处理后 WFS1 水平显著增加 。
3. 其他 ER 标记物的表达：研究人员监测了 ATF6（激活转录因子 6，Activator transcription factor 6）、PERK（胰腺 ER 激酶，Pancreatic ER kinase）、GRP78/BiP、CHOP（C/EBP 同源蛋白，C/EBP homologous protein，Ddit3 基因编码产物）以及 Xbp1 及其剪接变体 sXbp1 的基因表达。R 细胞中 Atf6、Eif2ak3（编码 PERK）和 Hspa5（编码 GRP78/BiP）基因表达高于 S 细胞。Tun 或 Thap 处理后，S 细胞中这些基因表达增加，而 R 细胞中则出现下降或不变的情况。CHOP 在未处理的 S 和 R 细胞中表达较低，Tun 或 Thap 处理后，S 细胞中其表达大幅增加，R 细胞中增加幅度较小。S 和 R 细胞中未剪接和剪接的 Xbp1 基因转录本无显著差异，但 Tun 或 Thap 处理后，S 细胞中剪接转录本增加幅度更大 。
4. 蛋白复合物的形成：免疫沉淀实验表明，在无 ERS 时，S 细胞中 WFS1 主要以糖基化形式与 ATF6 和 PERK 形成复合物，Tun 或 Thap 处理后糖基化形式减少；R 细胞中糖基化 WFS1 较少，非糖基化形式似乎占主导。Tun 或 Thap 处理后，S 和 R 细胞中 WFS1 与 GRP78/BiP 形成的复合物增加，且 R 细胞中增加更为明显。

研究结论和讨论部分指出，P-gp 阳性的 R 细胞中 Wfs1 基因在 mRNA 和蛋白水平均呈现高表达，这可能与 R 细胞对细胞外 Ca²⁺浓度变化的敏感性以及细胞内钙稳态的调节有关。同时，WFS1 作为 ERS 的负调节因子，可能通过与 ATF6、PERK 和 GRP78/BiP 形成复合物，参与调节细胞对 ERS 的反应。在 ERS 条件下，WFS1 与这些蛋白的相互作用发生变化，可能影响细胞的存活和凋亡。此外，研究还发现一些与预期不符的现象，如 Tun 或 Thap 处理后，GRP78/BiP 与 ATF6 的复合物含量增加，目前对此尚无明确解释，但推测可能与 WFS1 的过表达有关。

这项研究首次揭示了 WFS1 在 P-gp 阳性耐药细胞中的作用，为理解肿瘤细胞耐药机制提供了新的视角，也为未来开发针对肿瘤多药耐药的治疗策略提供了潜在的靶点和理论依据 。