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为解决微生物组扩增子测序数据受多种偏差干扰，阻碍临床应用的问题，研究人员开展了基于细菌形态学校正提取偏差的研究。结果显示，可利用 mock 社区样本校正偏差，该研究为克服微生物组分析中的实验方案偏差迈出重要一步。
在微生物研究的奇妙世界里，科学家们一直试图通过 16S rRNA 靶向基因测序，来揭开人类微生物组的神秘面纱，这一研究在环境和医学领域都至关重要。然而，就像在充满迷雾的森林中探索，研究结果的可重复性和普遍性却面临着巨大挑战。微生物组测序数据就像被施了魔法一样，受到多种因素的干扰。从 DNA 提取、污染，到扩增和测序过程中出现的错误，再到令人头疼的嵌合体形成，每一个环节都可能给数据带来偏差。这些偏差就像隐藏在暗处的 “小怪兽”，严重影响了研究结果的准确性，让不同研究之间的比较变得困难重重，也阻碍了临床微生物组应用的发展。尤其是 DNA 提取偏差，它就像一个顽固的 “大 BOSS”，至今都没有有效的解决办法，成为微生物组研究道路上的一块巨石。
为了战胜这些 “小怪兽”，来自国外多个研究机构的研究人员决定踏上探索之旅。他们以解开尚未解决的提取偏差之谜，以及探究其与细菌细胞形态学特性的关系为目标，开展了一项意义非凡的研究。研究成果发表在《Microbiome》杂志上。
研究人员使用了 ZymoResearch 提供的不同分类群和丰度组成的 mock 微生物群落标准品，构建了不同稀释度的 mock 样本，同时采集了皮肤微生物组样本。他们采用 8 种不同的提取方案，对样本进行处理，这些方案涵盖了 2 种提取试剂盒、2 种裂解条件和 2 种提取缓冲液。之后，对提取的 DNA 进行 16S rRNA 基因扩增和测序，并运用多种生物信息学方法进行数据分析。
在研究结果部分，首先是序列分类和序列错误分析。研究人员发现，不同 mock 样本中序列错误的比例差异较大。交错（staggered）mock 样本中正确序列的比例最高，在输入细胞数为 106的样本中，精确匹配的中位数达到 99.7%。而偶数（even）mock 样本中序列错误的比例明显更高，范围在 6.2% - 31.6%，中位数为 22.3%，且大多数序列错误的 ASV 只存在于输入细胞数为 108的样本中，主要集中在 8 个属于 L. fermentum、E. coli 或 S. enterica 的 ASV 上。
接着是嵌合体形成研究。令人惊讶的是，嵌合体形成与样本生物量呈正相关，输入细胞数为 108的样本中，嵌合体比例高达 13%，而输入细胞数≤105的样本中，嵌合体比例小于 0.026%。进一步分析发现，偶数 mock 样本中的嵌合体更加多样，主要由 S. aureus、B. subtilis 和 L. monocytogenes，或 P. aeruginosa 和 E. coli 等具有高序列相似性的物种对形成；交错 mock 样本中嵌合体形成较少，主要在 L. monocytogenes、B. subtilis 和 P. aeruginosa 之间形成。
在污染和交叉污染方面，研究表明，“未分类” ASV 的比例与细菌输入细胞数呈显著负相关。通过对这些 “未分类” ASV 的分析，发现大部分污染物来自提取缓冲液，同时还存在皮肤样本与 mock 样本之间的交叉污染。
对于提取方案的影响，研究人员发现，不同提取方案对样本组成有显著影响。在偶数 mock 样本中，提取试剂盒和裂解条件会显著改变样本组成，而提取缓冲液的影响较小；在交错 mock 样本和 spike - in 样本中，也得到了类似的结果。此外，皮肤样本中个体差异较大，掩盖了提取方案对样本组成的影响。
在探索哪种提取方案最佳时，研究人员发现没有一种方案能完美代表预期的 DNA mock 样本组成，且不同 mock 样本中最佳提取方案不同，这表明提取偏差不仅与方案有关，还与分类群有关。
最后是基于形态学的提取偏差校正研究。研究人员利用 metacal 方法计算提取偏差，发现不同物种的提取偏差存在显著差异，且这些差异与细菌的细胞形状和细胞壁结构有关。通过基于形态学的计算校正，显著降低了不同 mock 样本和皮肤样本中的提取偏差。
在研究结论和讨论部分，研究人员指出，微生物组测序数据受到多种因素的干扰，通过对 mock 社区样本的研究，揭示了提取偏差与细菌细胞形态学之间的新关联，并利用这一关联对提取偏差进行计算校正，有效降低了 mock 样本中的提取偏差，对皮肤微生物组样本的细菌组成也产生了显著影响。然而，该研究也存在一些局限性，如需要在更大规模的 mock 研究中进一步验证，目前对细菌特性的研究还局限于培养物种等。尽管如此，这项研究仍然为微生物组分析提供了新的思路和方法，为克服微生物组研究中的实验方案偏差奠定了基础，为未来的交叉实验方案荟萃分析和发现更可靠的临床微生物组关联铺平了道路。
