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在环境微生物组研究中，高通量测序虽带来便利，但相对丰度数据影响样本和研究间的比较。研究人员开展 “环境分析微生物学中基于细胞内标的绝对定量微生物组” 研究，总结多种绝对定量（AQ）方法，推荐基于细胞内标的高通量测序，为相关研究提供参考。
研究背景
在微观的生物世界里，环境微生物组如同一个神秘而庞大的 “小宇宙”，它由各种微生物细胞及其遗传物质组成，在自然生化过程和人工系统中都发挥着至关重要的作用。想象一下，土壤中的微生物就像一群勤劳的 “小工匠”，默默地参与着物质循环，帮助植物生长；而水体中的微生物，有的是净化水质的 “卫士”，有的却可能是危害健康的 “小恶魔”。
然而，目前环境微生物组研究遇到了难题。虽然高通量测序技术让我们能够深入探索这个 “小宇宙”，获得微生物组成的数据，但这些数据大多是相对丰度信息。这就好比我们只知道班级里每个同学的考试分数排名，却不知道他们的实际分数，很难对不同班级（不同样本）进行准确比较。而且，技术偏差会在样本采集、DNA 提取、测序等各个环节 “捣乱”，影响定量结果的可靠性。所以，为了更准确地了解环境微生物组，开展这项研究迫在眉睫。
香港大学的研究人员针对这些问题，开展了关于 “环境分析微生物学中基于细胞内标的绝对定量微生物组” 的研究。该研究成果发表在《Microbiome》上，为环境微生物组研究开辟了新的道路。
研究方法
研究人员综合运用多种方法进行研究。在估计微生物总量时，采用直接计数、间接微生物指标测量和分子方法等多种技术。在实现绝对定量方面，将当前方法分为两类：结合相对丰度与总微生物负荷的方法和基于内标（IS）的绝对定量方法。同时，通过建立数学方程，对各种方法涉及的参数进行精确计算和分析。
研究结果
- 总微生物负荷的估算：直接计数方法中，异养平板计数（HPC）和多管发酵技术会低估细胞总数，因为很多微生物难以培养；荧光显微镜计数和血细胞计数板计数受样本细胞分布和操作人员技能影响较大；流式细胞术（FCM）虽有优势，但在样本制备、设定和分析协议等方面存在挑战。间接微生物指标测量方法，如挥发性悬浮固体（VSS）、总 DNA 量等，由于受到非微生物颗粒和基因组大小等因素干扰，估算并不精确。分子方法中，定量聚合酶链反应（qPCR）和数字 PCR（dPCR）灵敏度高，但存在引物设计、污染和扩增偏差等问题；DNA 质量法宏基因组绝对定量受仪器测量和生物信息分析影响123。
- 基于 IS 的绝对定量：基于 IS 的绝对定量通过引入已知数量的 IS，将测序数据中的相对丰度转换为绝对丰度。IS 分为 DNA 基 IS 和细胞基 IS。DNA 基 IS 包括基因组 DNA（gDNA）和合成 DNA（sDNA），虽能用于计算绝对丰度，但无法校正 DNA 提取中的细胞裂解效率。细胞基 IS 则基于与内源微生物相似的提取效率和测序偏差假设，更适用于复杂环境样本，在多种研究中得到应用456。
- 解决 IS - 基于 AQ 的不确定性：优化 IS 添加量对准确量化至关重要，过少会导致偏差，过多会影响测序数据量。DNA 提取过程中的变异性可通过增加样本起始量、重复样本和均质化预处理来降低，使用细胞基 IS 能更好地计算 DNA 提取效率。不同研究对基于宏基因组测序的 AQ 方法的检测限（LoD）定义不一致，LoD 受测序深度、微生物负荷和物种特异性等因素影响。使用多个 IS 可从多方面提高 AQ 的准确性，还能校准技术变化。大多数 IS - 基于 AQ 方法通过模拟群落或其他独立计数技术进行验证，同时研究发现不同测序技术和生物信息分析因素会影响定量结果789。
- 环境分析微生物学（EAM）的应用：定量微生物组分析可避免组成性效应，重建微生物共现网络，揭示种间真实相互作用。定量微生物风险评估（QMRA）能确定微生物污染物的种类、数量、生存能力和传播潜力，为制定监管标准提供依据。将绝对丰度数据纳入数学模型，可提高模型的准确性和预测能力，促进模型发展。在工程系统中，利用绝对丰度数据可计算微生物污染物去除效率，评估功能微生物活性，优化系统设计101112。
研究结论与讨论
这项研究意义重大。它系统总结了多种绝对定量方法，强调基于细胞内标的高通量测序在环境微生物组研究中的优势，为解决当前研究中的难题提供了可行方案。同时，研究人员提出的技术考虑要素和清单，有助于提高绝对定量方法的可靠性和可行性，推动环境分析微生物学的发展。
不过，研究也存在一些局限性。例如，细胞内标对本地微生物种群的代表性不足，需要开发更多工程化细胞内标。未来研究可进一步优化实验设计，改进生物信息分析方法，减少偏差，提高绝对定量的准确性。相信随着研究的深入，环境微生物组的神秘面纱将被进一步揭开，为环境保护、人类健康和生态平衡等方面提供更有力的支持。
