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为解决庞贝病（PD）因 GAA 基因突变导致的异常剪接问题，研究人员开展了利用修饰的 U1 snRNA 纠正 GAA 基因外显子 2 跳跃变异的研究。结果显示部分修饰的 U1 snRNA 可提高外显子 2 的包含率，增加 GAA 酶活性。这为 PD 治疗提供了新策略。
庞贝病（Pompe disease，PD），又被称为糖原贮积症 II 型，是一种常染色体隐性遗传的溶酶体贮积病（lysosomal storage disorder，LSD）。它就像一个隐藏在人体细胞内的 “小恶魔”，由于酸性 α - 葡萄糖苷酶（acid alpha glucosidase，GAA）的活性缺乏，导致溶酶体内未消化的糖原不断堆积，进而引发细胞功能障碍，尤其是对心脏和骨骼肌造成严重影响。从临床症状来看，PD 患者的表现差异极大。婴儿型庞贝病（infantile-onset，IO）病情严重，若未及时诊断和治疗，患儿通常会在一岁内死于心肺并发症；而晚发型庞贝病（late-onset，LO）症状相对较轻，但也会逐渐发展为肢体无力、呼吸窘迫，最终可能依赖轮椅和呼吸机生活。
目前，酶替代疗法（enzyme replacement therapy，ERT）是治疗 PD 的唯一获批方法，它通过静脉注射重组人 GAA 蛋白，在挽救 IO - PD 患者生命方面发挥了重要作用。然而，这种疗法对 LO - PD 患者的效果却不尽如人意，骨骼肌对其反应不佳，这使得患者的治疗效果大打折扣。此外，庞贝病的致病基因 GAA 有多种变异类型，其中 c.-32-13T>G 变异在 LO - PD 患者中最为常见，它会干扰 GAA 前体 mRNA 的正确加工，导致外显子 2 跳跃，产生异常剪接异构体，从而影响 GAA 酶的正常功能。
在这样的背景下，来自意大利的研究人员（Regional Coordinator Centre for Rare Diseases, University Hospital of Udine 和 International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB)）开展了一项重要研究。他们试图探索一种新的治疗策略，以纠正由 c.-32-13T>G 等变异导致的异常剪接，为庞贝病患者带来新的希望。最终，该研究成果发表在《Molecular Medicine》杂志上。
为了实现这一目标，研究人员采用了多种关键技术方法。首先，他们构建了表达不同修饰 U1 snRNA 的质粒，并利用携带 GAA 基因突变的迷你基因（minigene）进行功能剪接测定，以此评估修饰 U1 snRNA 对 GAA 外显子 2 剪接的影响。同时，他们从携带 c.-32-13T>G 变异的 PD 患者皮肤活检中分离出原代成纤维细胞，进行细胞转染和电穿孔实验，通过实时定量 PCR（real-time qPCR）和 GAA 酶活性测定等方法，研究修饰 U1 snRNA 对患者细胞内源性 GAA 转录本和酶活性的影响。
研究结果如下：
- 修饰 U1 snRNA 对携带 c.-32-13T>G 变异迷你基因外显子 2 包含率的影响：研究人员设计了一组修饰的 U1 snRNA（U1 - 7、U1 - 3、U1 + 1 和 U1 + 6），通过细胞内实验发现，这些修饰的 U1 snRNA 能够不同程度地提高携带 c.-32-13T>G 变异的 GAA 迷你基因转录本中外显子 2 的包含率。其中，U1 + 1 效果最为显著，可使外显子 2 包含率提高约 2.5 倍。通过剂量响应实验进一步证实，外显子 2 包含率与 U1 浓度呈剂量依赖性关系12。
- 修饰 U1 + 1 snRNA 对携带不同外显子 2 剪接变异迷你基因的影响：除 c.-32-13T>G 变异外，研究人员还测试了 U1 + 1 snRNA 对其他 11 种影响 GAA 外显子 2 剪接的变异的作用。结果发现，U1 + 1 snRNA 对部分变异（如 c.-32-3C>G）能有效提高外显子 2 的包含率，但对某些变异（如 c.503G>C）则促进了隐蔽 3’剪接位点的使用，而对影响 5’剪接位点的变异，U1 + 1 snRNA 的效果因变异情况而异3。
- 修饰 U1 + 1 snRNA 对患者来源成纤维细胞的影响：在携带 c.-32-13T>G 变异的患者来源的永生化成纤维细胞和原代成纤维细胞中，转染 U1 + 1 snRNA 后，外显子 2 的剪接效率得到提高，正常 GAA mRNA 的量增加，GAA 酶活性也显著增强。在永生化成纤维细胞中，U1 + 1 处理使正常 GAA mRNA 增加约 1.8 倍，GAA 酶活性提高 70%；在原代成纤维细胞中，即使是低剂量的 U1 + 1 也能使 GAA 酶活性提高 50%45。
研究结论和讨论部分指出，本研究证明了利用修饰的 U1 snRNA 增强对 GAA 外显子 2 5’剪接位点的识别，是纠正携带常见和罕见外显子 2 剪接变异转录本正常剪接的有前景的策略。对于携带 c.-32-13T>G 变异的患者，这种方法有望通过提高功能性 GAA mRNA 的表达和 GAA 酶活性，达到预防病理性糖原积累的治疗效果。虽然修饰 U1 snRNA 的效果具有高度的突变依赖性，且受其他顺式或反式作用剪接因子的影响，但该研究为庞贝病的治疗开辟了新的方向，未来有望进一步优化 U1 设计，提高治疗效果。同时，AAV 介导的修饰 U1 递送在多种疾病小鼠模型中已显示出良好的应用潜力，为后续的临床研究奠定了基础。
