噬菌体展示肽库扩增过程中序列组成的比较分析：揭示不同批次间的异质性及其对配体筛选的影响

编辑推荐：本研究通过NGS技术对Ph.D.-12噬菌体展示肽库的两个批次进行三轮扩增比较，首次系统揭示了不同批次间存在的序列组成异质性（如野生型克隆比例、多样性差异）及扩增过程中Pr-TUPs（传播相关非靶向肽）的富集规律，发现批次特异性进化轨迹和RAMAY等关键扩增相关基序，为优化噬菌体展示筛选策略提供了重要依据。

　　噬菌体展示技术自George Smith开创以来，已成为发现功能性多肽的重要工具，其中Ph.D.-12肽库作为最常用的商业化文库，其复杂性理论上可达10⁹种序列。然而，该技术在实践过程中面临两大核心挑战：一是不同批次文库间的组成异质性长期被忽视，二是扩增过程会引入传播相关非靶向肽（Pr-TUPs）的干扰，这些因素严重影响筛选结果的可靠性。尽管已有研究通过NGS分析筛选结果，但对原始文库组成及其扩增动态的系统研究仍属空白。

丹麦哥本哈根大学医院的研究团队在《Virology Journal》发表了一项开创性工作。他们选取两个不同批次的Ph.D.-12文库（批次号10111202和10122218），通过三轮重复扩增实验，结合Illumina平台NGS测序（读长250bp）和定制化Python/MATLAB生物信息学分析，系统比较了氨基酸组成、序列多样性、富集因子（EF）及基序特征的变化规律。研究特别关注了扩增过程中EF>10²的高富集肽段，并采用STREME工具进行基序挖掘，同时分析了β-转角相关四肽基序的分布特征。

研究结果首先揭示了惊人的批次间异质性：两个批次的原始文库竟无任何共同序列，且野生型克隆比例（10.36% vs 5.99%）和独特序列比例（61.89% vs 96.66%）存在显著差异。扩增过程中，这种异质性进一步扩大——第三轮扩增后，SA1批次野生型占比飙升至90.37%，而SA2仅达61.81%。通过EF分析发现，两个批次分别产生完全不同的高富集肽段群体（最高EF达18,861.05 vs 126,105.90），且这些肽段在批次间无重叠，证实了Pr-TUPs的批次特异性。

氨基酸频率分析显示，两个批次在扩增过程中呈现不同的进化轨迹：SA1中苯丙氨酸、精氨酸过表达而天冬氨酸、谷氨酰胺低表达；SA2则呈现色氨酸、酪氨酸富集但丙氨酸、丝氨酸减少的特征。值得注意的是，位置特异性分析发现第1位亮氨酸在扩增中持续低表达，而第1位甘氨酸/丝氨酸则显著富集，提示N端氨基酸对噬菌体增殖的关键影响。

基序分析鉴定出多个与扩增速率相关的特征序列。其中五肽"RAMAY"在SA1批次中表现出持续富集（富集评分ES达13.3），其核心三肽"MAY"在所有扩增轮次均保守存在。相比之下，β-转角相关四肽基序（如DPNG、PNWN）虽被检出，但其ES值普遍低于1.5，且N端分布稀少，否定了其与增殖速率的强相关性。

这项研究首次从多维度揭示了商业化噬菌体展示文库存在的批次异质性及其扩增动态规律，其重要意义体现在三方面：首先，明确不同批次文库可能产生完全不同的筛选结果，建议研究需注明具体批次信息；其次，建立的EF评估体系和基序数据库（补充材料含Top1000富集肽段列表）为区分真实靶向肽和Pr-TUPs提供了过滤工具；最后，发现的关键扩增相关基序（如RAMAY）为理性设计高稳定性文库提供了分子线索。这些发现将显著提升噬菌体展示技术在靶向药物递送、分子影像等生物医学应用中的可靠性。