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为解决猪圆环病毒 3 型（PCV3）和 4 型（PCV4）因相似临床症状及共感染导致的诊断难题，研究人员开展了开发同时检测 PCV3 和 PCV4 的双重实时重组酶辅助扩增（RAA）法的研究。结果显示该方法便捷、灵敏、特异，为相关疾病防控提供有力支持。
在猪的养殖世界里，猪圆环病毒如同隐藏的 “杀手”，给养猪业带来了不小的麻烦。猪圆环病毒家族不断壮大，目前已发现 4 种成员，其中猪圆环病毒 1 型（PCV1）被证实无致病性 ，但 PCV2 却是引发猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的重要病原体，给全球畜牧业造成了巨大的经济损失。随着科学技术的发展，PCV3 和 PCV4 这两种新型病原体也相继被发现，它们在全球多个国家和地区的家猪和野猪群体中被检测到，偶尔还会在其他健康动物身上现身。
PCV3 和 PCV4 感染引发的临床症状主要包括猪皮炎肾病综合征（PDNS）、繁殖障碍、呼吸道疾病和腹泻等 。而且，它们单独感染时症状可能较轻微，甚至不出现亚临床症状，但一旦与其他猪圆环病毒或猪病原体共同感染或继发感染，就会使病情加重。由于这些症状相似，难以从临床上区分，再加上目前对于 PCV3 和 PCV4 的发病机制尚不明确，这给相关疾病的预防和控制带来了极大的挑战。因此，开发一种能够快速、准确且同时检测 PCV3 和 PCV4 的方法迫在眉睫。
为了解决这一难题，浙江省动物疫病预防控制中心等机构的研究人员开展了一项研究，成功开发出一种双重实时重组酶辅助扩增（RAA）法，相关研究成果发表在《Virology Journal》上。这一成果意义重大，为 PCV3 和 PCV4 的精准诊断和流行病学研究提供了可靠的工具，有助于更好地防控相关疾病，保障养猪业的健康发展。
研究人员在开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。首先是核酸提取技术，从临床样本和人工添加样本中提取病毒核酸，用于后续检测；其次是引物和探针设计与合成技术，根据 PCV3 和 PCV4 的基因组序列设计特异性引物和探针；最后是双重实时 RAA 检测技术及优化，建立并优化反应体系，对样本进行检测 。
下面来看看具体的研究结果：
- 筛选最佳引物和探针组合：研究人员对 30 种 PCV3 菌株和 29 种 PCV4 菌株的全基因组序列进行比对，找出高度保守区域，设计了多组引物和探针。经过筛选实验，确定 PCV3 F2R2 P2/PCV4 F2R2 P1 为最佳引物 - 探针组合，该组合在靶向各自保守区域时扩增性能更好，速度更快，荧光值更高。
- 优化反应体系：通过对引物对和探针浓度进行一系列稀释梯度实验，发现 400 nM 的 PCV3 和 PCV4 引物对以及 150 nM 的 PCV3 和 PCV4 探针浓度组合，能产生最佳扩增效果，荧光信号更强，反应时间更短 。
- 分析方法的特异性：利用该方法对 9 种临床重要猪病原体的核酸和标准质粒进行检测，结果显示，该方法仅对 PCV3 和 PCV4 标准质粒及二者混合物呈阳性扩增，与其他常见猪病毒无交叉反应，特异性良好。
- 测定方法的敏感性：将 PCV3 和 PCV4 标准质粒进行 10 倍系列稀释后作为模板进行扩增实验，通过概率回归分析确定该方法对 PCV3 和 PCV4 的检测限均为 73.67 拷贝 / 反应（95% 置信区间），表明其敏感性可靠。
- 评估方法的重复性和再现性：使用不同浓度的标准质粒进行批内和批间实验，结果显示批内变异系数（CV）在 2.08 - 3.91% 之间，批间 CV 在 3.33 - 4.97% 之间，均低于 5%，说明该方法重复性和再现性良好。
- 检测临床样本和人工添加样本：对 60 个样本（55 个临床样本和 5 个人工添加样本）进行检测，并与 qPCR 法对比。结果显示，双重实时 RAA 法与 qPCR 法检测结果的总体符合率较高，kappa 值分别为 0.966（PCV3）和 1（PCV4），表明该方法可应用于临床实践。
综合研究结论和讨论部分，这项研究成功建立了一种能够同时快速检测 PCV3 和 PCV4 的双重实时 RAA 法。该方法检测操作简单，能在 39℃、20 分钟内高效完成。它具有良好的特异性、敏感性、重复性和再现性，是准确诊断 PCV3 和 PCV4 以及开展流行病学研究的可靠工具。此外，该方法在临床样本检测中表现出色，对共感染的检测效果显著，检测结果与 qPCR 法相当，适合用于 PCV3 和 PCV4 的初步临床检测。这一研究成果为兽医病原体的多重检测提供了坚实的基础，提升了对 PCV3 和 PCV4 的防控能力，也为新兴圆环病毒的流行病学研究提供了有力支持。未来，研究人员还将探索将该方法与可视化技术相结合，开发更便于现场检测的设备和技术，进一步推动猪圆环病毒检测技术的发展。
