脉冲电场处理后微藻双相脂质萃取：降低下游能耗，助力生物炼制发展

为解决微藻脂质萃取能耗高、溶剂回收难等问题，研究人员开展了脉冲电场（PEF）处理后微藻双相脂质萃取的研究。结果表明，该方法显著降低溶剂消耗和能耗，提升萃取效率。这为微藻生物炼制商业化提供了更优方案，推动相关领域发展。

　　在当今生物能源与生物产品开发的前沿领域，微藻作为极具潜力的原料，备受关注。微藻是一类水生的微观光合生物，生长迅速，能在多种环境中繁殖，其产物多样，尤其是脂质，在生物燃料、食品、饲料等行业都有广泛应用前景。不过，在微藻脂质的提取过程中，却面临着诸多难题。传统的脂质萃取技术大多依赖有机溶剂，像氯仿、甲醇等虽被视为实验室脂质提取的 “金标准”，但因其毒性问题，无法大规模应用。即便换成如己烷、乙醇等相对安全的溶剂，微藻坚硬的细胞壁又成了脂质高效萃取的 “拦路虎”。细胞壁主要由纤维素、半纤维素等多糖构成，极大地阻碍了细胞内脂质的提取。而且，现有脂质萃取工艺不仅效率有待提高，能耗也相当高，特别是在溶剂回收环节，这严重制约了微藻生物炼制产业的发展。所以，探寻一种高效、低耗的微藻脂质萃取新方法迫在眉睫。

在这样的背景下，德国卡尔斯鲁厄理工学院（Karlsruhe Institute of Technology）的研究人员勇挑重担，开展了一项意义非凡的研究。他们将目光聚焦在脉冲电场（PEF）处理后的微藻脂质萃取上，旨在探索如何优化这一过程，降低下游处理的能源需求。经过一系列严谨的实验和深入的分析，研究人员取得了令人瞩目的成果。他们发现，在 PEF 处理后对微藻进行孵育，能显著加快脂质萃取的速度，10 分钟就能提取出大部分脂质。同时，采用双相乙醇：己烷：水（1:6:0.4 vol/vol/vol）溶剂体系进行萃取，虽然该体系对新鲜微藻效果不佳，但对孵育后的微藻却效果显著，不仅大幅减少了乙醇的用量，还将整个过程的能源需求降低了多达 90%。这一研究成果发表在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》上，为微藻生物炼制产业的发展带来了新的曙光。

为开展这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：

1. 脉冲电场（PEF）处理技术：利用定制的处理腔室，对收获后的湿微藻施加不同能量密度（0.25 MJ/kg 和 1.5 MJ/kg）的 PEF 处理，使微藻细胞膜穿孔，增加细胞通透性。
2. 脂质萃取技术：分别采用单相机乙醇：己烷：水（1:0.41:0.04 vol/vol/vol）和双相乙醇：己烷：水（1:6:0.4 vol/vol/vol）溶剂体系，对新鲜或孵育 24 h 后的微藻进行脂质萃取，并研究萃取动力学。
3. 细胞染色与成像技术：通过 Yo-Pro 染色和流式细胞术检测微藻细胞膜的通透性；用尼罗红（Nile - Red）染色后，借助荧光显微镜观察微藻脂质的分布和环境极性变化。
4. 能量评估计算：根据实验数据，对脂质萃取过程中各主要步骤（如 PEF 处理、离心、混合、溶剂分离等）的能量需求进行计算，并评估能量消耗比（ECR）。

下面来详细了解一下研究结果：

1. Yo-Pro 摄取实验结果：Yo-Pro 摄取实验用于检测微藻细胞膜的透化程度。实验结果显示，未经处理的微藻只有约 1% 被 Yo-Pro 染色，且孵育 24 h 后该比例几乎不变，说明微藻在孵育过程中细胞膜通透性稳定。而经 1.5 MJ/kg 能量处理的微藻，处理后立即有 94% 被 Yo-Pro 染色，表明细胞膜迅速透化；0.25 MJ/kg 能量处理的微藻，处理后即刻染色比例为 27%，孵育后提升至 86%。这表明较低能量的 PEF 处理可通过孵育时间来弥补细胞膜透化程度，使不同能量处理的微藻在孵育后逐渐趋于一致。
2. 单相脂质萃取动力学：研究人员使用单相乙醇：己烷：水共溶剂体系对微藻进行脂质萃取动力学研究。结果发现，若在 PEF 处理后直接萃取，0.25 MJ/kg 能量处理的微藻，10 分钟时脂质产率仅 3.5% 干重，240 分钟后才升至 4.4%，1080 分钟时为 9.2%；1.5 MJ/kg 能量处理的微藻，10 分钟时产率 6.5%，1080 分钟时达 24.8%。若在 PEF 处理后孵育 24 h 再萃取，两种能量处理的微藻在 10 分钟时脂质产率都显著提高（分别为 28.8% 和 31.2% 干重），240 分钟时继续上升，之后趋于稳定，最终产率分别为 37.2% 和 39.3%。这表明孵育不仅能降低 PEF 处理所需能量，还能加快萃取进程。同时，实验数据符合 Patricelli 模型，该模型描述了萃取过程中快速溶解和缓慢扩散两个阶段，进一步揭示了脂质萃取机制。
3. 微藻脂质分布的显微镜检查：通过对固定和染色后的微藻进行荧光显微镜观察，研究人员发现，未处理的微藻脂质呈大液滴状，在 GFP 和 RFP 通道均有明显信号。低能量（0.25 MJ/kg）PEF 处理后，24 h 孵育使信号主要集中在 RFP 通道，且细胞结构模糊；高能量（1.5 MJ/kg）PEF 处理后，细胞结构立即消失，荧光均匀分布，孵育后所有细胞在 RFP 通道发出均匀信号，且细胞壁似有脱离细胞的现象。这一系列变化表明，孵育后脂质所处环境极性增加，不再局限于特定液滴内，而是与其他细胞成分混合。
4. 双相脂质萃取：基于孵育对微藻脂质萃取动力学和极性的影响，研究人员尝试采用双相脂质萃取系统。实验结果显示，该系统对新鲜微藻脂质萃取效果不佳，但对孵育后的微藻效果显著。0.25 MJ/kg 和 1.5 MJ/kg 能量处理后孵育的微藻，脂质产率分别提升至 23% 和 27% 干重，分别达到总评估脂质的 59% 和 69%。双相萃取系统不仅减少了萃取过程中的溶剂用量，还省略了相分离步骤，降低了乙醇用量，具有重要的经济价值。
5. 脂质萃取的能量评估：研究人员对脂质萃取过程的能量需求进行评估后发现，各萃取路径的能量消耗比（ECR）均大于 1，即脂质萃取消耗的能量大于其所含能量，主要原因是有机溶剂（尤其是乙醇）的回收能耗高。而双相萃取系统通过减少溶剂用量，使 ECR 相比单相萃取降低了近 10 倍，即便其萃取效率略低于单相萃取（69% 对 96%）。这充分表明溶剂类型和用量对萃取过程的能量需求影响巨大，也为后续优化提供了方向。

综合上述研究结果，研究人员得出结论：PEF 处理后孵育微藻，对脂质萃取具有多重积极影响，不仅提高了萃取动力学，还使得双相萃取系统得以成功应用。这种方法大幅减少了乙醇用量，降低了整个过程的能源需求，显著改善了微藻脂质萃取工艺的商业前景。不过，目前双相萃取方法的萃取效率还有提升空间，未来可进一步研究优化，比如探索其他替代乙醇的溶剂，以避免乙醇与水形成共沸物带来的问题。此外，还可对己烷的多次循环使用进行深入研究，提高资源利用率。总之，这项研究为微藻生物炼制领域开辟了新的道路，为后续相关研究和产业发展提供了重要的理论和实践依据，有望推动微藻在生物能源、生物产品等领域的广泛应用，助力实现可持续发展目标。