从分批补料到连续培养：解构地衣芽孢杆菌重组蛋白酶生产的工艺转换潜力

本期推荐：奥地利维也纳理工大学与德国巴斯夫团队创新性地将地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)重组蛋白酶生产从传统fed-batch模式转向连续培养。研究通过建立混合动力学模型，首次揭示解阻遏诱导系统在两种培养模式下的特异性生产率(qp)差异，证明连续培养在39%稀释率(D)时达到69% qp，虽时空产率(STY)仅为fed-batch的46%，但为工业酶生产的可持续转型提供了关键理论依据。

　　

在工业生物制造领域，蛋白酶作为能够水解肽键的多功能生物催化剂，广泛应用于洗涤剂、制药和食品加工等行业。传统采用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)通过分批补料(fed-batch)培养生产重组蛋白酶，虽然工艺成熟，但存在设备利用率低、能耗高等可持续性问题。而连续培养(chemostat)理论上能提高设备效率、降低碳足迹，但关于芽孢杆菌属的连续培养研究匮乏，特别是采用解阻遏(derepressed)诱导系统的工艺转换机制尚不明确。

针对这一技术空白，维也纳理工大学与巴斯夫公司的Stefan Kittler团队在《BMC Biotechnology》发表创新研究。团队选择具有工业应用价值的地衣芽孢杆菌工程菌株，其携带基于碳源调控的解阻遏启动子系统——这种系统通过降低而非完全切断碳源供应来诱导蛋白表达，相比传统诱导方式更能维持细胞生理稳态。研究通过对比fed-batch与chemostat两种模式下的代谢动力学，首次揭示了培养模式对解阻遏系统效率的深远影响。

关键技术方法包括：1）采用两级预培养策略，从TB培养基过渡到专利限定培养基；2）在1L生物反应器系统中精确控制pH(7.0)、溶氧(>30%)等参数；3）通过在线气体分析仪监测CO₂/O₂代谢通量；4）建立混合动力学模型，整合比底物消耗率(q_s)和累积代谢负荷(q_s,cum)双变量预测q_p；5）使用N-succinyl-AAPF-pNA显色法量化蛋白酶活性。

"Studying the effects of growth rates and substrate uptake rates on product formation"部分显示：在fed-batch筛选中，恒定qs为48%的筛选1比18%的筛选2提前17小时达到OD₆₀₀>250，但q_p反而降低22%，证明高生长速率反而抑制解阻遏效率。而chemostat在D=39%（对应qs=50%）时达到最佳平衡，q_p比D=24%提高23%，且稳定性显著优于fed-batch。

"Model validation and detailed chemostat screening"验证了模型的预测能力：训练集（D=24%/39%/72%）NRMSE为14.2%，验证集（D=19%/49%/57%）为18.1%。特别发现当D>57%（qs>78%）时启动子完全阻遏，产物滴度归零，这与fed-batch中观察到的"代谢负担累积导致q_p随时间衰减"形成鲜明对比。

讨论部分指出三个关键发现：1）解阻遏系统存在"双阈值效应"——qs需>30%维持诱导，但<78%避免阻遏；2）连续培养的世代数效应比fed-batch更显著，q_p在30-35代后下降50%；3）fed-batch筛选结果不能直接外推至chemostat设计，因两者q_p-qs关系呈现相反趋势。虽然当前chemostat的STY（最高46%）尚未超越fed-batch（131%），但研究建立的模型为后续开发级联式连续培养或细胞截留系统奠定基础。

这项研究的意义在于：首次量化揭示了解阻遏诱导系统在连续培养中的动态规律，突破了"fed-batch经验直接移植"的传统思维。提出的混合模型（结合高斯分布与指数衰减函数）可预测不同D和世代数下的q_p，为生物过程数字化提供了新工具。尽管工业化应用仍需提升STY，但研究为可持续生物制造提供了理论框架，特别对需要长期诱导的次级代谢产物生产具有启发价值。