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本文是一篇关于纳米抗体（Nb）工程的综述，详细阐述了 Nb 工程的最新进展。涵盖了免疫、天然和合成 / 半合成等文库构建策略，噬菌体展示、酵母展示等多种筛选平台技术，以及人工智能在预测 Nb 结构、优化理化性质等方面的应用，对该领域研究有重要参考价值。
纳米抗体（Nb）的独特魅力与研究背景
纳米抗体（Nb）源自骆驼科动物重链抗体（HCAbs）或软骨鱼类新抗原受体（NARs），由重链可变区（VHH）及恒定区 CH2、CH3 结构域构成 。其尺寸小巧，仅约 2.5nm×4nm，分子量约 15kDa，是已知最小的抗原结合单位。VHH 含有三个互补决定区（CDR）和四个框架区（FR），凭借独特的结构，如 CDR3 的手指状凸结构、FR2 的氨基酸替换等，赋予了纳米抗体高稳定性、强特异性以及出色的抗原结合能力，能够识别常规抗体难以触及的抗原表位。
纳米抗体在疾病诊断与治疗领域展现出巨大潜力。在诊断方面，与荧光蛋白、生物传感器或酶偶联后，可用于探究复杂的细胞内信号通路，还能实现体内细胞成像，助力疾病的早期精准诊断。在治疗领域，纳米抗体在对抗病毒感染、肿瘤以及中枢神经系统疾病等方面均取得了一定进展，能够跨越血脑屏障，为这些疾病的治疗带来了新的希望。
纳米抗体文库的构建策略
获取包含目标基因组信息的文库对于产生高特异性和亲和力的纳米抗体至关重要。目前主要有免疫文库、天然文库和合成 / 半合成文库这三种类型。
- 免疫文库：通常通过用目标免疫原免疫骆驼（如双峰驼、单峰驼、羊驼等）来构建。在两个月内多次免疫，最后一次免疫后采集 50 - 100mL 血液，分离淋巴细胞，提取 mRNA 并转化为 cDNA，再通过巢式 PCR 扩增 VHH 基因区域。免疫文库中的纳米抗体具有亲和力成熟、靶向特异性强的特点，但构建过程需要动物免疫，且针对不同项目可能需要构建多个文库。
- 天然文库：当某些分子无免疫原性、无法刺激产生 HCAbs 或对动物有害时，天然文库是一种可行选择。构建天然文库无需动物免疫，但需要从 10 - 20 只动物采集超过 10L 血液以获取足够的 B 淋巴细胞。其文库规模较大，可用于多种项目，但其中的纳米抗体亲和力相对较低，通常需要进行体外成熟优化。
- 合成 / 半合成文库：在免疫不可行或生物样本稀缺的情况下，合成 / 半合成文库成为构建纳米抗体文库的有力替代方案。设计合成文库时，框架序列设计注重稳定性和通用性，可参考已报道的框架或共识序列；CDRs 设计强调多样性和有效性，尤其是 CDR3，可通过完全随机化、结构引导等方法进行设计。合成 / 半合成文库具有无需动物参与、多样性高的优势，为纳米抗体的开发提供了更多可能性。
纳米抗体的展示平台技术
构建高质量的纳米抗体文库后，还需要借助有效的展示平台来筛选和优化纳米抗体。展示平台可分为表面展示技术和非表面展示技术。
- 病毒 - 表面展示：主要包括噬菌体展示和真核病毒展示，其中噬菌体展示应用最为广泛。噬菌体展示通过将纳米抗体基因与噬菌体外壳蛋白基因融合，使纳米抗体在噬菌体表面表达。经过 3 - 5 轮生物淘选及 ELISA 等方法筛选，可获得高亲和力的纳米抗体。该技术能展示大量不同的纳米抗体，且可连续复制，但存在展示大小受限、缺乏某些真核生物翻译后修饰等问题。
- 细胞 - 表面展示
- 酵母展示：利用酵母的靶向分泌途径，使纳米抗体在酵母细胞表面表达。常用的酵母有酿酒酵母（S.cerevisiae）和毕赤酵母（P.pastoris），通过 MACS 和 FACS 等技术筛选。酵母展示能实现蛋白质的正确折叠和翻译后修饰，可产生具有不同结合特异性的多克隆群体，但存在蛋白质错误折叠和部分纳米抗体糖基化影响其功能的问题。
- 细菌展示：以大肠杆菌（E.coli）为代表，将纳米抗体基因插入载体，通过不同途径在细菌表面表达。细菌展示具有产量高、文库多样性大、成本低等优势，但原核生物缺乏人类样的翻译后修饰，可能影响纳米抗体的稳定性和免疫原性。
- 真菌展示：如曲霉属等真菌可作为细胞工厂表达纳米抗体。真菌具有真核生物的翻译后加工机制，但在生产异源蛋白（包括纳米抗体）时，产量常不尽人意，可能与分泌过程中蛋白酶的影响有关。
- 哺乳动物细胞展示：哺乳动物细胞（如 CHO、HEK293 等细胞系）适合生产功能完整、免疫原性低的纳米抗体。传统方法转染重组基因载体后筛选稳定克隆耗时较长，新兴方法如瞬时基因表达（TGE）和重组酶介导的盒式交换（RMCE）可提高生产效率，但哺乳动物细胞展示在翻译后修饰优化（尤其是糖基化）方面仍面临挑战。
- 植物细胞展示：植物细胞展示系统可提供类似哺乳动物细胞的翻译后修饰，且安全无害。纳米抗体可在植物的叶、种子等组织及不同亚细胞区室中表达，种子具有长期保存稳定性和口服应用的潜力。然而，植物特异性的二次修饰可能增加免疫原性，下游纯化成本也较高。
- 昆虫细胞展示：昆虫细胞（如鳞翅目细胞）利用杆状病毒表达系统（BES）表达纳米抗体，具有产量高、蛋白质折叠正确和翻译后修饰等优点，但产生的 N - 糖基化纳米抗体免疫原性相对较高，目前研究聚焦于提高产量和改善糖基化模式。
- 非表面展示
- 核糖体展示：通过形成蛋白质（Nb） - 核糖体 - mRNA（PRM）复合物，实现基因型和表型的偶联。该技术无需细胞培养和转染，可在体外进行纳米抗体的进化和筛选，文库规模大，但存在 PRM 复合物不稳定和核糖体 - 核糖体碰撞等问题。
- mRNA 展示：与核糖体展示类似，通过构建 DNA 文库转录成 mRNA，形成蛋白质 - mRNA 复合物。mRNA 展示利用短 DNA - 嘌呤霉素接头防止肽链释放，使复合物更稳定，但仍面临 mRNA 降解的挑战。
此外，新兴技术如 Nestlink、Sybody 以及高通量测序与质谱鉴定相结合的方法，为纳米抗体的发现和表征带来了新的突破，提高了筛选效率和准确性。
人工智能在纳米抗体工程中的应用
人工智能（AI）在纳米抗体工程中具有重要意义，可克服传统方法的局限性，加速纳米抗体的开发。
- 纳米抗体结构预测：深度学习方法显著提升了蛋白质结构预测的准确性，对纳米抗体 VHH 结构的研究也有重要推动作用。通用的蛋白质结构预测工具如 AlphaFold2、RoseTTAFold 等，虽不是专门为纳米抗体设计，但在预测 VHH 结构方面有一定应用价值。同时，专门针对纳米抗体设计的算法如 NanoNet、NanoBodyBuilder2 等，在预测 VHH 结构时具有更高的精度和效率，为纳米抗体的合理设计提供了有力支持。
- CDR3 结构预测：CDR3 是纳米抗体识别抗原的关键区域，预测其结构具有重要意义。目前多种模型在 CDR3 结构预测方面存在一定挑战，H3 - OPT 算法综合利用多种方法的优势，在高精度 CDR3 结构预测上表现出色，为纳米抗体的设计和优化提供了关键信息。
- 纳米抗体 - 抗原相互作用预测：预测纳米抗体 - 抗原的结合位点和模式对理解其特异性和抗原识别机制至关重要，但面临诸多挑战。新工具 NanoBERTa - ASP 和 NbX 的出现为解决这些问题带来了希望。NanoBERTa - ASP 基于序列信息预测抗原结合位点，NbX 则从结构层面优化结合构象，两者相辅相成，为纳米抗体的设计提供了更全面的指导。
- 纳米抗体多反应性优化：多反应性会影响纳米抗体的药代动力学和临床应用，AI 通过建立机器学习模型，可从序列数据预测纳米抗体的多反应性，并指导氨基酸突变优化，为纳米抗体的合理设计和临床应用扫除障碍。
- 纳米抗体理化性质优化：AI 在优化纳米抗体的理化性质方面发挥着重要作用。通过计算亲和力成熟、调整氨基酸电荷分布等方法，可提高纳米抗体的结合亲和力、稳定性等性能。同时，基于深度学习的模型如 nanoBERT，可预测氨基酸突变对纳米抗体结构和功能的影响，为纳米抗体的性能优化提供了新的思路和方法。
纳米抗体工程的现状与展望
目前，纳米抗体工程在文库构建、展示平台技术和人工智能应用等方面取得了显著进展。不同类型的文库各有优劣，为纳米抗体的开发提供了多样化的选择；多种展示平台技术不断发展和完善，提高了纳米抗体的筛选和生产效率；人工智能的引入则为纳米抗体的设计和优化带来了新的机遇。
然而，纳米抗体工程仍面临一些挑战。在数据方面，需要建立统一的数据标准，提高数据的标准化、规范化和可确定性，以实现不同来源和格式数据的有效管理和利用。在免疫原性方面，计算设计的纳米抗体可能存在潜在的免疫原性问题，需要进行更全面的临床前和临床研究。此外，开发更直观、易用的人工智能工具，让更多科研人员能够熟练使用，也是未来需要解决的问题。
展望未来，纳米抗体文库将更加复杂和多样化，通过引入新的支架和设计策略，如整合计算优化的框架和先进的诱变技术，可进一步提高文库的多样性和功能性。展示平台将不断创新，多种展示方法的融合和混合方法的发展，有望进一步提高筛选效率，发现更多稀有、高性能的纳米抗体克隆。人工智能将在纳米抗体工程中发挥更重要的作用，随着纳米抗体序列和结构数据的不断积累，将开发出更准确、通用的人工智能模型，实现从结构预测、抗原相互作用建模到性质优化和从头设计的全面应用。
纳米抗体作为一种极具潜力的生物分子，在疾病诊断和治疗等领域具有广阔的应用前景。随着纳米抗体工程技术的不断发展和完善，它将为生命科学和健康医学领域带来更多的惊喜和突破，推动精准医学和生物技术的进步，为人类健康事业做出更大的贡献。
