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为解决现有斑马鱼行为分析软件存在的与动态背景不兼容、缺乏多孔板格式支持、硬件要求高及编程难度大等问题，研究人员开展了 Marigold 这一免费开源网络应用的研究。结果显示 Marigold 功能强大且易用，对分析斑马鱼行为意义重大。
在生命科学研究的舞台上，斑马鱼因其独特的优势，如繁殖量大、发育迅速、神经系统相对简单且拥有许多人类疾病基因的同源物，成为了研究脊椎动物行为、毒理学以及神经系统疾病模型构建的热门对象。然而，现有的斑马鱼行为分析软件却像是一道道阻碍研究进展的 “关卡”。传统基于经典图像处理技术的软件，在面对动态背景、变化的光照条件以及早期胚胎与背景对比度低的情况时，表现得十分脆弱；很多软件只能追踪代表幼虫整体位置的单个点，无法满足对多个关键点追踪的需求；还有些软件是闭源的，与专有硬件绑定，限制了研究人员的使用和定制。而基于机器学习的先进软件虽然精度高，但往往需要高端图形处理单元（GPU）才能高效运行，复杂的工作流程也让缺乏专业技术知识的人员望而却步，并且它们对斑马鱼常用的实验范式，如多孔板成像，缺乏支持。
在这样的背景下，美国马萨诸塞大学阿默斯特分校（University of Massachusetts Amherst）的研究人员决心开辟新的道路，他们开展了关于 Marigold 这一免费开源网络应用（web app）的研究。经过不懈努力，研究人员成功开发出 Marigold，它能可靠地追踪多达 10 个用户定义的身体关键点，支持单孔和多孔配置，拥有用户友好的界面。这一成果发表在《BMC Bioinformatics》上，为斑马鱼行为分析领域带来了新的曙光。
研究人员在开发 Marigold 的过程中，运用了多种关键技术方法。首先，他们收集并标记了两个原理验证数据集，分别用于触摸诱发反应和视觉运动反应研究。接着，基于 PyTorch 库对神经网络架构进行原型设计和优化，通过一系列宏观架构和微观架构的设计改进，提升网络性能。最后，利用 C++ 生成 WebAssembly，将相关功能集成到网络应用中，实现了在浏览器内的高效运行 。
在神经网络设计方面，研究人员以 MobileNetV3 倒置瓶颈残差块为基础，探索了两种宏观架构 —— 分层架构和各向同性架构。研究发现，各向同性架构在训练和推理速度、内存占用等方面表现更优。在微观架构上，将批归一化（Batch Normalization）替换为实例归一化（Instance Normalization），并适当去除部分归一化和激活层，进一步提升了训练和推理速度，减少了理论内存占用。同时，研究表明，即使训练数据有限，Marigold 的神经网络仍能有效训练。在 WebAssembly 实现上，Marigold 的基于 WebAssembly 的神经网络实现，在 CPU 性能上与高度优化的 PyTorch 库相当。
在生物学实验应用中，研究人员使用 Marigold 对 slc1a2btk57/tk57突变体和野生型斑马鱼胚胎的触摸诱发反应进行研究。结果发现，头部刺激后，突变体胚胎的游泳时间和距离显著长于野生型；在尾巴刺激实验中，不同基因型的胚胎在初始弯曲幅度、达到最大角度的时间等方面存在差异。这表明突变体胚胎的运动表型存在与基因型和触摸位置相关的特征。此外，研究人员还利用 Marigold 研究了发育阶段和喂养对斑马鱼幼体视觉运动反应行为的影响。研究表明，喂养状态对 7 日龄幼体的视觉运动反应行为影响更为显著，在黑暗适应、光照刺激等不同阶段，喂养和未喂养的幼体在游泳活动水平、最大速度、游泳回合数等方面均存在差异。
综合研究结论和讨论部分，Marigold 的出现意义非凡。在生物学实验中，它能够帮助研究人员深入挖掘斑马鱼行为的细节，发现新的行为特征和规律。在神经网络设计上，其优化的架构为开发高效的神经网络提供了新的思路。与现有软件相比，Marigold 降低了硬件要求，消除了安装程序，更易于使用。尽管它目前存在一些局限性，如只能分析每个感兴趣区域的单个动物、在处理高分辨率长时记录时速度有限等，但未来有望通过扩展功能，如支持多鱼分析和三维姿态追踪，进一步提升其应用价值，为斑马鱼行为研究乃至其他物种的行为分析提供强有力的支持。
