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在全外显子测序（WES）用于疾病相关遗传变异检测面临诸多挑战的情况下，研究人员开展了对 Agilent、Roche、Vazyme 和 Nanodigmbio 四款外显子富集试剂盒的比较研究。结果显示各试剂盒表现出色，Roche 覆盖最均匀，Nanodigmbio 精度高。该研究为科研和临床选择合适试剂盒提供参考。
在生命科学和医学领域，全外显子测序（Whole exome sequencing，WES）犹如一把精准的 “基因手术刀”，聚焦于基因组中编码蛋白质的区域，对于识别与疾病相关的遗传变异起着至关重要的作用。过去十年间，它在临床诊断中的应用日益广泛，极大地提升了对疾病遗传因素的认知。然而，WES 技术并非尽善尽美。其实验室操作流程复杂且敏感，缺乏统一标准，在实现全面且均匀的覆盖、保证高灵敏度和特异性以及维持成本效益等方面困难重重。不同的外显子富集试剂盒在性能上存在差异，这使得研究人员和临床医生在选择时面临困惑。因此，开展对外显子富集试剂盒的比较研究迫在眉睫，其有助于更深入了解各试剂盒的特性，为实际应用提供有力指导。
俄罗斯皮罗戈夫俄罗斯国立研究医科大学（Pirogov Russian National Research Medical University）等机构的研究人员开展了此项研究。他们对四款外显子富集试剂盒 ——Agilent SureSelect Human All Exon v8、Roche KAPA HyperExome、Vazyme VAHTS Target Capture Core Exome Panel 和 Nanodigmbio NEXome Plus Panel v1 进行了比较评估。研究结果表明，四款试剂盒在关键性能指标上表现出色，都可作为外显子测序的可靠选择，但又各有优势。这一研究成果发表在《BMC Genomics》上，为相关领域提供了重要的参考依据。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先，准备了 96 个 DNA 文库，包括 18 名患者的 72 个文库（每个患者 4 个，对应四款试剂盒）和 E701 参考 DNA 的 24 个文库（每个试剂盒 6 个）。随后，将文库分组富集，使用 MGI Universal DNA Library Prep Set 制备文库，经 Covaris 超声破碎仪处理和片段筛选后，在 DNBSEQ - G400 平台测序。生物信息学分析方面，运用 FastQC 和 BBDuk 对测序数据进行质量评估和修剪，通过 bwa - mem2 将 reads 比对到参考基因组 GRCh38.p14，使用 Picard 和 SAMtools 计算相关质量指标，用 bcftools mpileup 和 DeepVariant 进行变异检测。统计分析则借助 Python3 完成。
探针设计比较
现代外显子富集试剂盒的目标区域大小已缩小至约 30Mb，主要聚焦于外显子区域。研究中的四款试剂盒，Agilent V8 Exome、Vazyme、Nanodigmbio 和 Roche KAPA 的目标区域大小分别为 35.13Mb、34.13Mb、35.17Mb 和 35.55Mb，其中 92.14%（33.86Mb）的区域是四款试剂盒共有的。它们与 Gencode V44 和 RefSeq 数据库的交集也显示出较高的一致性，这表明各试剂盒在目标区域选择上存在一定的重叠性。
目标覆盖度比较
对四款试剂盒生成的测序数据进行分析，发现其平均生成的 reads 数为 69.5M，且映射到 hg38 参考基因组的比例均超 99.99%。在评估富集质量时，将 reads 下采样至约 50M，结果显示，Nanodigmbio 因脱靶 reads 较少，其靶向 reads 数比例较高（87%），而 Agilent V8、Roche 和 Vazyme 的靶向 reads 数比例相近（76 - 78%）。在中位目标覆盖度上，Vazyme 和 Nanodigmbio 略高，分别为 64x 和 70x，Agilent V8 和 Roche KAPA 则为 61x 和 60x。衡量覆盖均匀性的 fold - 80 指标显示，Roche 的得分最低（1.43 ± 2.13%），意味着其覆盖最均匀。此外，所有试剂盒在 10x 覆盖度下，目标区域的覆盖比例均超 97.5%；在 20x 覆盖度下，均超 95%。
GC 含量分析
研究人员分析了不同 GC 含量的目标区域的归一化覆盖度。使用 RNA 诱饵的 Agilent 平台在较宽的 GC 含量范围内表现出最高的归一化覆盖度，尤其在 30% GC 含量时表现突出。而使用 DNA 诱饵的 Vazyme、Nanodigmbio 和 Roche 平台在中等 GC 含量（30 - 70%）和低 GC 含量（<30%）下表现相似，但 Vazyme 在高 GC 含量（>70%）时覆盖度较低。
难测序区域和 ACMG 基因的覆盖度比较
研究人员针对难测序区域和 ACMG 基因的覆盖度进行研究。结果显示，四款试剂盒在覆盖这些区域时均面临挑战，没有一款试剂盒表现特别突出。在覆盖 MedGen 数据库中与疾病相关的基因时，Nanodigmbio 的 20x 覆盖度比例最高（97.19 ± 0.17%）。对于 ACMG 推荐检测的 81 个基因组成的 Bed 文件，所有试剂盒的 10x 覆盖度平均比例均超 98.2%，但各试剂盒仍存在少量未覆盖区域。
标准 DNA 的变异检测
研究人员利用标准人类 DNA 样本 E701 对不同试剂盒检测遗传变异的能力进行研究。结果发现，Nanodigmbio 试剂盒的检测结果与其他试剂盒差异较大，其假阳性变异数最少，但未检测到的变异数最多。其他试剂盒的召回率较高，尤其是 Agilent V8。衡量精度和召回率平衡的 F - measure 指标显示，Roche、Agilent V8 和 Vazyme 均超 96%，Nanodigmbio 略低，为 95.87%。
研究结论和讨论部分指出，四款试剂盒在性能上各有优劣。Roche 提供了最均匀的外显子覆盖，在需要均匀覆盖的研究场景中具有优势；而在需要高召回率的应用中，Roche、Agilent V8 和 Vazyme 更为合适；对于追求高精度的场景，Nanodigmbio 是较好的选择。此外，研究首次评估了中国公司 Vazyme 和 Nanodigmbio 的新产品，发现它们的性能与行业领先的 Agilent V8 和 Roche KAPA 试剂盒相当。尽管外显子捕获技术取得了进展，但难测序区域的覆盖仍然是一个难题，这与短读长测序技术以及探针设计等因素相关。该研究为研究人员和临床医生在选择外显子富集试剂盒时提供了全面的参考，有助于推动精准医学的发展，使基因检测在疾病诊断和治疗中发挥更大的作用。
