恶性胆道狭窄中染色体外环状DNA的综合图谱及其致癌作用研究

本研究针对恶性胆道狭窄诊断标志物匮乏的临床难题，通过纳米孔测序技术首次系统解析了胆汁游离染色体外环状DNA(bcf-eccDNA)的特征图谱。研究发现bcf-eccDNA在癌组呈现6个特征性峰型，携带LINC00598/CELF2等基因的分子具有>0.9的AUC诊断价值，并通过创新性GALA方法证实eccMIR-106a/363和eccMIR-374b/421簇可调控PI3K-Akt等通路促进肿瘤进展。该研究为胆道恶性肿瘤提供了新型液体活检标志物和潜在治疗靶点。

　　

胆道系统恶性肿瘤因其隐匿性强、诊断困难，患者五年生存率不足15%。传统血清标志物如CA19-9和CEA特异性有限，而组织活检又面临取样困难等问题。更棘手的是，这类肿瘤具有高度异质性，现有治疗手段效果欠佳。在此背景下，北京大学第三医院消化内科黄永辉团队与清华大学长庚医院合作，将目光投向了一种新型分子——胆汁中的染色体外环状DNA(eccDNA)。这种环状结构比线性DNA更稳定，且因胆汁直接接触胆道病变部位，可能携带更特异的肿瘤信息。该团队通过创新性研究，首次绘制了恶性胆道狭窄患者bcf-eccDNA的全景图谱，相关成果发表在《Cell》杂志。

研究采用了两阶段队列设计，首先纳入28例接受ERCP检查的疑似胆道狭窄患者（最终确诊17例恶性、11例良性），后续又设立12例的验证队列。关键技术包括：1）基于外切酶消化和滚环扩增的eccDNA富集策略；2）纳米孔长读长测序技术；3）首创的GALA（Gibson Assembly large-circle accumulation）方法用于合成复杂eccDNA；4）通过RNA-seq和功能实验验证eccDNA的致癌机制。

在"bcf-eccDNA的尺寸特征与起源偏好"部分，研究发现恶性组eccDNA呈现~200bp至~1150bp的六个特征峰，且显著长于良性组（P<0.05）。全基因组分布分析显示恶性组eccDNA更倾向源自chr2/5/14等染色体，且在全基因组呈随机分布，反映肿瘤基因组不稳定性增加。"诊断性bcf-eccGene的发现"章节揭示，携带LINC00598或CELF2的eccDNA在训练组和验证组均显示优异诊断性能（AUC>0.9），与血清CA19-9联用可进一步提升至AUC≥0.95。值得注意的是，在"eccDNA携带的致癌突变"部分，通过COSMIC数据库注释发现RUNDC1等基因存在Tier3级癌症相关突变，并经Sanger测序验证。

研究最突出的发现在于"癌症特异性eccEnhancer"和"eccMIR簇"的功能解析。通过SEdb2.0数据库比对，鉴定出92个恶性特异的eccEnhancer，其靶向基因如IFNGR2在TCGA胆道肿瘤中高表达且与不良预后相关（P<0.05）。更引人注目的是，团队利用自创的GALA技术合成eccMIR-106a/363和eccMIR-374b/421簇，转染HepG2细胞后证实：1）显著上调对应miRNA表达（2-△△Ct法验证）；2）RNA-seq显示激活PI3K-Akt/MAPK等致癌通路；3）促进细胞增殖（CCK-8检测P<0.01）并抑制凋亡（流式检测晚期凋亡率下降35%）。

讨论部分强调了三方面突破：1）首次建立胆汁eccDNA图谱，其六峰特征可能反映核小体包装规律；2）LINC00598/CELF2等标志物克服了传统标志物特异性不足的缺陷；3）GALA技术突破了大片段eccDNA合成的技术瓶颈。局限性在于样本量较小且ERCP操作门槛较高。未来方向包括：扩大队列验证诊断模型、探索eccDNA在靶向治疗中的应用。该研究不仅为胆道恶性肿瘤提供了新型无创诊断工具，其揭示的eccDNA致癌机制也为开发靶向eccMIR簇的治疗策略奠定基础。