编辑推荐：
为解决 FFPE 组织切片存储时间和温度是否影响蛋白质组分析的问题，研究人员开展了 FFPE 组织切片在室温（RT）与 - 80°C 下存储 48 周的稳定性研究。结果显示存储时间和温度对其蛋白质组分析影响不大，表明 FFPE 组织切片适合至少 48 周后的蛋白质组学研究。
在生命科学和医学研究领域，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本是一种极为重要的资源。它相比新鲜冷冻（FF）组织更容易获取，并且能在常温下长期保存。FFPE 样本常用于组织病理学、免疫组化（IHC）检测特定蛋白质，还能为临床诊断和治疗决策提供关键依据。然而，在蛋白质组分析方面，FFPE 样本存在一些问题。此前，人们并不清楚 FFPE 切片长期存储后用于液相色谱 - 质谱（LC-MS）分析是否会受到影响。在 IHC 检测中，FFPE 切片存储会导致部分蛋白质抗原性下降，影响检测效果，但这种情况是否会在 LC-MS 分析中出现尚不明确。在实际的 LC-MS 蛋白质组研究中，由于样本收集的复杂性，从 FFPE 组织块切片到处理成肽段的时间差异很大，这种差异对蛋白质组分析结果的影响也未可知。为了解决这些问题，来自澳大利亚悉尼大学医学院、儿童医院医学研究所等机构的研究人员开展了相关研究。
研究人员首先从成年雄性 Wistar 大鼠获取脑、肾和肝脏组织，制备 FFPE 组织块。从每个组织块切取不同厚度的切片，用于 H&E 染色和蛋白质组分析。实验设计了 11 个时间点，分别在第 1、2、3、4、8、12、16、20、24、37 和 48 周进行检测。将切片分为三组，一组新鲜切割作为对照，另外两组分别在室温（约 22°C）和 -80°C 下存储。同时，还使用了人类口咽组织切片进行研究。
研究中用到的主要关键技术方法包括：采用 Heat ‘n Beat（HnB）方法处理样本用于 LC-MS 分析，先去除石蜡，再进行蛋白质的裂解和消化；运用数据依赖采集（DDA）和数据非依赖采集（DIA）两种模式对样本进行 LC-MS 分析；使用 ProteinPilot、MSFragger、DIA-NN 等软件进行数据处理和分析，并通过统计分析（如配对 t 检验、Bonferonni-Dunn’s 多重比较等）来评估结果。
研究结果如下：
- 肽产量和消化效率：在 48 周的实验期间，新鲜切割（对照）和存储切片的肽产量（μg 肽每 mm2组织）存在一定差异，但这种差异与存储时间和温度无关，可能是由于组织块切片时组织含量的变化导致。所有组织类型的消化效率均高于 80%，不受存储时间和温度的影响。
- 蛋白质和肽的鉴定：通过 DDA 模式分析，在 1% 错误发现率（FDR）下，除第 12 周存储的样本外，蛋白质和肽的鉴定数量在时间和温度上没有显著差异。而且，肽鉴定数量受分析时仪器性能的影响更大。
- 蛋白质修饰：常见的蛋白质翻译后修饰（PTM），如脱酰胺和氧化，在存储过程中没有显著变化。对 FFPE 样本常见的 9 种修饰进行定量分析，发现其丰度在肾和肝样本中相对稳定，不受存储时间和温度的影响。
- 样本聚类分析：对肽段进行无监督层次聚类分析和主成分分析（PCA），结果表明样本主要根据组织类型和实验时间点聚类，而不是存储温度。在肾脏样本的 PCA 分析中，对照样本与存储样本在第三主成分上有一定分离，但在肝脏样本中未观察到这种现象。
- 长期存储影响：对存储 4 - 13 年的口咽肿瘤 FFPE 组织块切片进行分析，发现组织块年龄对肽产量、定量蛋白质和肽的数量没有明显影响，常见 FFPE 修饰也没有随组织块年龄显著变化。
研究结论和讨论部分指出，FFPE 样本用于蛋白质组分析的局限性曾被认为是由甲醛诱导的交联和修饰造成的，但目前的样本制备技术已克服这些问题。本研究表明，FFPE 组织切片在存储 48 周内，无论是整体蛋白质组还是 FFPE 相关修饰，在不同温度下存储对蛋白质组分析的影响都不显著。这意味着 FFPE 组织切片适合至少 48 周后的蛋白质组学研究，其母组织块至少在 10 年内也适合蛋白质组分析。虽然不能完全排除某些蛋白质的鉴定可能受存储时间影响，但总体而言，FFPE 组织样本在生物样本库中具有很大的应用潜力，适合用于蛋白质组分析、生物标志物的发现和验证，尤其适用于大规模回顾性研究，因为其样本量大且有相关病理和临床数据支持。该研究成果为 FFPE 样本在蛋白质组学研究中的应用提供了重要依据，推动了相关领域的发展，发表在《Clinical Proteomics》上。
