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在植物微生物组研究中，宿主叶绿体和线粒体 rRNA 基因序列的共扩增干扰了细菌 16S rRNA 基因群落分析。研究人员针对此开展橡木相关微生物群 16S rRNA 基因分析中 PNA 夹应用的研究，结果显示 PNA 夹能减少宿主序列扩增、增加细菌多样性，为植物微生物研究提供了有效方法。
在植物的微观世界里，有一群 “小伙伴” 与植物的健康息息相关，它们就是植物微生物组。植物微生物组是生活在植物组织上或内部的微生物集合，就像一个小小的生态系统，其中一些微生物能帮植物抵抗疾病，比如产生抗菌、抗真菌物质，或者通过竞争空间和资源来抑制有害病菌；还有的能协助植物获取营养，让植物茁壮成长。
要想深入了解这个微观世界，研究人员常用 PCR 扩增和 DNA 测序的方法，分析细菌和古细菌的 16S rRNA 基因，以此推断微生物群落的组成。然而，这个过程遇到了一个大麻烦。原来，真核生物宿主的叶绿体和线粒体，在进化过程中保留了和原核生物一样的 16S rRNA 区域。在进行 PCR 扩增时，这些叶绿体和线粒体的 rRNA 基因序列会一起被扩增出来，就像 “捣乱分子” 一样，干扰了对植物相关细菌序列的分析。比如，在一些植物研究中，宿主质体 PCR 扩增产物在根中的平均水平达到 23%，某些植物家族甚至高达 62 - 94%。在地上部分组织中，由于叶绿体数量多，这种干扰更严重，导致细菌 16S rRNA 基因序列读取量很低，不仅浪费了测序成本，还无法全面反映细菌的多样性。
为了解决这个问题，英国班戈大学（School of Natural Sciences, Bangor University）等机构的研究人员展开了一项研究。他们把目光投向了肽核酸（PNA）夹。PNA 夹是一种核酸类似物，它可以在 PCR 过程中 “出手”，通过阻止引物结合或抑制 DNA 聚合酶的功能，来防止特定 DNA 链的扩增。研究人员想看看，PNA 夹能不能减少宿主叶绿体和线粒体的扩增，更准确地分析橡木（Quercus robur 和 Q. petraea）相关微生物群的 16S rRNA 基因。这项研究成果发表在了《Environmental Microbiome》上。
研究人员为了开展这项研究，主要用到了以下几个关键技术方法：首先是样本采集，他们从英国 4 个地点采集了橡木的叶、树皮和根样本；接着进行 DNA 提取，针对不同组织样本采用不同的提取方法；然后设计并使用 PNA 夹，包括通用叶绿体（p）PNA 夹和新设计的线粒体（m）PNA 夹；之后进行 16S rRNA 基因 PCR 扩增、测序和定量 PCR（qPCR），对样本中的微生物群落进行分析；最后通过生物信息学分析和统计分析，来评估 PNA 夹的效果。
下面我们来看看研究结果：
- PNA 夹减少宿主污染并增加细菌读数：研究发现，添加 PNA 夹后，叶、树皮和根组织中宿主叶绿体和线粒体 16S rRNA 基因序列分别减少了 79%、46% 和 99%，细菌测序读数平均分别增加了 72%、35% 和 17%。这表明 PNA 夹有效减少了宿主的 “捣乱”，让细菌序列能更好地被检测到。
- PNA 夹增加细菌多样性且不影响微生物组成：通过对细菌群落的多样性分析，发现添加 PNA 夹后，叶和树皮样本中的细菌多样性显著提高，根样本中则没有明显变化。同时，研究还表明组织和物种对细菌群落组成影响较大，而 PNA 夹的使用并没有显著改变微生物的组成，这说明 PNA 夹不会给细菌群落分析带来偏差。
- PNA 夹显著降低宿主叶绿体绝对丰度：利用 qPCR TaqMan 检测进一步验证，PNA 夹能显著降低宿主叶绿体的 PCR 扩增，但对宿主线粒体序列的抑制效果不明显。这提示研究人员，在针对线粒体的研究中，可能还需要进一步优化 PNA 夹的设计。
综合研究结论和讨论部分，这项研究意义重大。PNA 夹在减少宿主叶绿体和线粒体 PCR 扩增方面表现出色，大大提高了对橡木相关细菌多样性的评估准确性。不过，目前针对线粒体的 PNA 夹还存在一些不足，比如对某些线粒体 ASV 的抑制效果不够理想。未来研究可以朝着优化 PNA 夹浓度、开发更多针对不同线粒体序列变体的 PNA 夹的方向努力。这项研究为植物微生物组研究提供了新的思路和方法，有助于更深入地了解植物与微生物之间的关系，为植物健康保护和农业生产等领域提供有力支持。
