从 DYW 家族细菌毒素脱氨酶到新型碱基编辑器：开启植物与哺乳动物细胞精准编辑新篇

为解决开发新型碱基编辑工具的问题，研究人员开展了将 DYW 家族细菌毒素脱氨酶 SsdA 改造为新型胞嘧啶碱基编辑器（CBE）的研究。结果显示，改造后的 SsdAG103S-v1-CBE 在植物和哺乳动物细胞中均能高效实现 C-to-T 编辑。这为作物改良和人类基因治疗提供了新工具。

　　在生命科学的探索旅程中，基因组编辑技术一直是科学家们手中的神奇钥匙，开启了精准改造生物遗传信息的大门。早期，像 CRISPR/Cas9、TALEN 和 ZFN 这样的位点特异性核酸酶，让科学家能够在目标位点产生缺失或随机突变，从而使特定基因失活。但随着研究的深入，人们不再满足于此，期望能有更精确的工具，实现特定核苷酸的交换，用于纠正人类疾病相关的单核苷酸多态性（SNPs），或是创造重要作物性状的等位基因变体 。于是，碱基编辑器应运而生。

碱基编辑器主要分为胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）和腺嘌呤碱基编辑器（ABEs），它们通常由 Cas9 切口酶（nCas9）作为靶向结构域，与能够对目标 DNA 碱基进行脱氨作用的酶结构域融合而成。在哺乳动物细胞和植物细胞中，已经有多种脱氨酶被应用于碱基编辑器的构建，比如在哺乳动物细胞中使用大鼠的 APOBEC1 和大肠杆菌腺嘌呤脱氨酶 TadA 的变体 TadA8e，在植物细胞中则尝试过人类的 APOBEC3A（hA3A）、hAID 和海七鳃鳗的 PmCDA1 等。然而，这些已有的脱氨酶在实际应用中存在一些问题，比如在植物中 APOBEC1 活性较低，而且目前的碱基编辑工具仍有进一步优化的空间，因此开发新型碱基编辑结构域的需求持续存在。

在此背景下，德国汉诺威莱布尼茨大学植物遗传学研究所等机构的研究人员展开了深入研究。他们将目光聚焦在一种来自植物致病细菌丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的单链 DNA 脱氨酶毒素 A（SsdA）上，期望将其改造为新型的胞嘧啶碱基编辑器，为作物改良和人类基因治疗提供更强大的工具。这项研究成果发表在《Genome Biology》杂志上。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。首先是质粒构建技术，从丁香假单胞菌 pv. aptata 中扩增 SsdA_tox，通过点突变 PCR 生成 SsdA 变体，并将相关组件基于 Modular Cloning-compatible（MoClo）载体进行组装 。在细胞实验方面，利用农杆菌介导的转化技术，将构建好的质粒导入植物细胞，同时使用原生质体分离和转化技术研究碱基编辑器在植物原生质体中的编辑效果。对于哺乳动物细胞，则通过将构建好的慢病毒载体转导至细胞系，分析碱基编辑情况。此外，还运用了测序技术，包括 Sanger 测序和扩增子深度测序，来检测突变情况。

研究结果主要体现在以下几个方面：

• 低毒 SsdA_tox变体的筛选：研究人员将 SsdA_tox与 nCas9 - UGI 融合构建 CBE，并在植物 GUS 报告系统中测试其碱基编辑活性时发现，转化 SsdA_tox-CBE 的农杆菌菌落形成单位（CFU）显著降低，推测是 2×35S 启动子在农杆菌中有低背景活性，产生的 SsdA_tox-CBE 蛋白对细胞有毒性。随机挑选存活的农杆菌单菌落测序后，发现 SsdA_tox编码区域存在 C-to-T 转换导致的氨基酸变化，如 D77N、S87F、G103S 和 Q113stop 等。通过定点突变验证，发现 D77N 和 G103S 变体在大肠杆菌和农杆菌中转化后的 CFU 与 hA3A-CBE 相当，表明这些变体消除了 SsdA_tox的毒性。
• 内含子降低 SsdA 毒性：为进一步降低 SsdA 在细菌中的毒性，研究人员设计了两种在 SsdA_tox编码序列中插入内含子的变体（SsdA_v1 和 SsdA_v2）。内含子在细菌中可终止翻译，但在真核生物中剪接后能正确翻译。在烟草（Nicotiana benthamiana）的 GUS 报告基因实验中，携带 SsdA_v1-CBE 或 SsdA_v2-CBE 的农杆菌与携带 GUS^G537报告基因的菌株混合浸润烟草叶片，结果显示两种碱基编辑器均能实现碱基编辑，且 SsdA_v1 的编辑效率更高，证明 SsdA 可作为新型 CBE 工具的催化结构域。
• 工程化 SsdA-CBE 诱导高效 C-to-T 编辑：研究人员随机挑选 10 个转化原始 SsdA_tox-CBE 二元载体的农杆菌单菌落，与携带 GUS^G537报告基因的菌株混合浸润烟草叶片，发现部分叶片区域 GUS 活性较高。对活性增加的克隆 #7 进行连续培养和测序，发现 SsdA^G103S变体逐渐积累。进一步对 G103 位点进行不同氨基酸替换（G103S、G103R、G103A 和 G103C）并测试，结果显示 SsdA^G103S-v1-CBE 的 GUS 活性相比无内含子的 SsdA^G103S有显著提升，表明 SsdA_tox可被改造为高效的胞嘧啶碱基编辑工具。
• SsdA^G103S是单链 DNA 特异性脱氨酶：为探究 SsdA 是否能在体内对双链 DNA（dsDNA）中的胞嘧啶进行脱氨，研究人员将 SsdA_tox-v1 或 SsdA^{G103S - v1}与单个 TALE 阵列蛋白融合，使用针对 GUS^G537报告基因的不同 TALE 阵列进行实验。结果显示，与 TALE-hA3A 融合（阴性对照）相比，所有 TALE-SsdA_tox-v1 和 TALE-SsdA^{G103S - v1}融合体的 GUS 活性均为背景水平，而 SsdA^G103S-v1 与 nCas9-UGI 融合（阳性对照）的 GUS 活性约为 80%，表明 SsdA_tox和 SsdA^G103S是单链 DNA 特异性胞嘧啶脱氨酶。
• 合理截短 SsdA^{G103S - v1}获得小型脱氨酶：基于 SsdA 的晶体结构，研究人员对 SsdA^G103S进行合理截短，生成了 5 种不同的截短变体（SsdA^G103S-T1 至 SsdA^G103S-T5）。在烟草的 GUS^G537报告基因实验中测试这些变体的编辑效率，发现 N 端截短的 SsdA^G103S-T1、SsdA^G103S-T2 和 SsdA^G103S-T3 与全长 SsdA^G103S蛋白的 GUS 活性相当，而 C 端和 C/N 端截短的 SsdA^G103S-T4 和 SsdA^G103S-T5 仅显示背景 GUS 活性，表明 C 端的 β 链对酶活性至关重要，成功将 SsdA^G103S的蛋白大小缩短至 114 个氨基酸。
• SsdA^{G103S - v1}-CBE 在水稻和大麦原生质体中编辑窗口较窄：研究人员利用水稻和大麦的原生质体，针对多个基因组位点进行编辑实验。结果显示，SsdA^G103S-v1-CBE 能够在水稻和大麦的基因组位点上有效实现 C-to-T 转换，且编辑窗口较窄，最佳靶向胞嘧啶位于原间隔序列的 C5 至 C8 位置。
• SsdA^{G103S - v1}在水稻植株中高效碱基编辑：通过农杆菌介导的转化方法，将 SsdA^G103S-v1-CBE 应用于水稻植株的多个基因组位点编辑。结果显示，该编辑器在不同位点的编辑效率为 30% - 58.8%，且编辑窗口较窄。编辑后的水稻植株产生了如抗除草剂等有益性状，同时研究还发现 SsdA^G103S-v1-CBE 和 hA3A-CBE 均会诱导脱靶编辑。
• SsdA^{G103S - v1}在哺乳动物细胞中的碱基编辑活性：将人密码子优化的 SsdA^G103S-v1-CBE（HucoSsdA^G103S-v1-CBE）克隆到慢病毒载体中，转导至 293 T 细胞和 K562 细胞。结果显示，在靶向区域观察到 3% - 48% 的总突变，包括 C-to-T 转换导致的新终止密码子形成，证明 SsdA^G103S-v1-CBE 在哺乳动物细胞中具有活性。
• SsdA_tox同源物的结构系统发育分析：利用 Foldseek 工具对可能与 SsdA_tox功能相关的蛋白质进行挖掘，通过结构比对和保守基序筛选，发现 18 个与 SsdA_tox结构相似的候选蛋白，推测它们可能具有胞嘧啶脱氨酶催化活性，有望被开发为新型 CBEs。

研究结论表明，新开发的 SsdA^G103S衍生的碱基编辑器扩展了基因组编辑工具库，能够在植物和哺乳动物细胞中精确高效地实现 C-to-T 转换，编辑窗口更窄，可实现更精准的碱基靶向。截短后的 SsdA^G103S-T3 是目前基因组编辑工具中最小的脱氨酶。这些成果为作物改良和人类基因治疗提供了有价值的新选择，在农业生产和医学治疗领域具有广阔的应用前景，推动了生命科学和健康医学领域的进一步发展。