CRISPR/Cas 系统新突破：PCE8pro驱动高效双子叶植物基因组编辑

为解决植物 CRISPR/Cas 系统编辑效率差异大的问题，研究人员开展了利用钙网蛋白启动子（PCE8pro）驱动 CRISPR/Cas 系统在双子叶植物中进行基因组编辑的研究。结果表明该系统编辑效率高，能实现多基因编辑和染色体片段删除，为双子叶植物基因研究和育种提供新工具。

　　在生命科学领域，植物基因组编辑研究正如火如荼地开展着。基因组编辑技术，尤其是由成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas 系统介导的编辑技术，在研究植物功能基因组学以及改良作物农艺性状方面有着巨大的潜力。然而，当前的研究面临着一个棘手的问题：不同植物中 CRISPR/Cas 系统的编辑效率差异极大。比如，传统的以 35S 启动子（35S_pro）和 pol III 启动子构建的 CRISPR/Cas 系统，在植物基因组编辑时，产生的纯合 / 双等位基因（homozygous/bi-allelic，ho/bi）突变较少，这在多倍体作物中表现得尤为明显。为了突破这一困境，中国农业科学院烟草研究所等机构的研究人员展开了深入研究，其成果发表在《Molecular Horticulture》上。

研究人员开展的是利用钙网蛋白启动子（PCE8_pro）驱动 CRISPR/Cas 系统在双子叶植物中进行基因组编辑的研究。他们发现 PCE8_pro能有效驱动 Cas9 核酸酶，在 T0 代再生双子叶植物中实现高效编辑，且该编辑系统可用于多基因编辑和染色体片段删除，这为双子叶植物的基因研究和分子育种提供了全新的有力工具。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先是构建 CRISPR/Cas9 表达盒，将不同的启动子与 Cas9 和 sgRNA 进行组合。其次是利用农杆菌介导转化法，把构建好的表达盒导入烟草、生菜和番茄等双子叶植物中。最后通过对目标基因的表型观察、高通量测序以及 PCR 扩增和测序等技术，来分析编辑效率和突变类型。

一、PCE8_pro驱动的 CRISPR/Cas9 系统设计

研究人员注意到一个在烟草愈伤组织中高表达的基因 PCE8，其编码一种钙网蛋白样蛋白（calreticulin-like protein，CRT），且在烟草芽再生早期表达量极高。PCE8 的启动子（PCE8_pro）含有与分生组织表达、激素和伤口响应相关的顺式元件。基于此，研究人员推测 PCE8_pro可能适用于烟草基因组的高效靶向编辑。于是，他们构建了三种 CRISPR/Cas9 表达盒 pDC30、pDC40 和 pDC45，分别用不同的启动子组合控制 sgRNA 和 SpCas9 的表达。

二、系统编辑效率评估

研究人员选择烟草八氢番茄红素去饱和酶（Phytoene desaturase，NtPDS）基因作为目标基因，因为 NtPDS 基因被破坏的烟草幼苗会呈现白化表型，便于判断其等位基因是否被编辑。实验结果显示，pDC40 和 pDC45 转化的烟草产生白化苗的数量显著高于 pDC30。进一步针对多个基因设计 gRNAs 进行高通量测序，结果表明 pDC40 转化的植株在各靶点的突变率较高，且 ho/bi 突变比例也明显高于 pDC30，pDC45 的效果则更优。同时，研究人员还发现 PCE8_pro驱动的 Cas9 表达水平更高，这与编辑效率的提升密切相关。

三、pDC45 系统的多基因编辑能力

研究人员开发了 pDC45 双 sgRNA（pDC45_dsg）系统用于烟草的多基因编辑。针对 NtPDS 基因设计两个 gRNAs，结果发现 pDC45_dsg 转化的烟草产生白化苗的数量大幅增加，且部分植株出现了片段缺失。对 NtWOX1 基因的编辑也证实了该系统能有效实现片段删除，甚至可以创造大的染色体片段缺失，删除效率达到 11.1%。此外，pDC45_dsg 系统还能提高在 sgRNA 效率较低位点的编辑活性，在多个基因编辑实验中展现出较高的编辑效率和 ho/bi 突变比例。

四、pDC45 系统在其他双子叶植物中的应用

考虑到钙网蛋白样蛋白在植物中的高度保守性，研究人员评估了 pDC45 系统在生菜和番茄中的编辑效率。在生菜中，pDC45 系统对 LsPDS 基因的编辑效率高达 60%，55.0% 的植株出现白化表型，而 pDC30 系统的编辑效率仅为 16.5%。在番茄中，针对白粉病抗性因子 SlMLO 和茉莉酸（JA）信号通路的关键转录因子 SlMYC2 进行编辑，pDC45 系统也取得了较高的 ho/bi 突变效率。研究还发现，不同物种来源的 PCE8 启动子都能有效促进基因组编辑，显示出该启动子的通用性。

五、pDC45_Fast 系统的开发与应用

研究人员构建了 pDC45_Fast 系统，该系统可在基因编辑的同时使植物提前开花。在烟草和番茄中，pDC45_Fast 系统对多个基因的编辑效率较高，且编辑后的植株出现了早期抽薹和结果的现象，大大缩短了生长周期。对 T1 代植株的分析表明，pDC45_Fast 系统产生的纯合突变是可遗传的，并且可以通过早期开花的表型筛选出无转基因的编辑植株，不过该系统在植物再生过程中也存在一些不良影响，如部分植株根系发育缺陷和提前开花导致无法收获种子等问题。

研究结论表明，研究人员成功鉴定出 PCE8_pro这一新型启动子，其驱动的 pDC45 系统在双子叶植物中展现出高效的基因编辑能力，可实现多基因编辑和染色体片段删除。pDC45_Fast 系统则为快速筛选无转基因编辑植株提供了新方法。这些编辑系统为双子叶植物的基因功能研究、分子育种等领域开辟了新途径，有助于加速植物基因工程的发展，推动相关领域的研究取得新突破，在未来的植物科学研究和农业生产中具有广阔的应用前景。