β-葡萄糖苷酶VmGlu1通过降解黄酮类化合物调控苹果腐烂病菌致病力的机制研究

本期推荐：苹果树腐烂病病原菌Valsa mali通过β-葡萄糖苷酶VmGlu1特异性降解黄酮类化合物芦丁(rutin)和根皮苷(phloridzin)，调控毒素产生和分生孢子器(pycnidia)形成。青岛农业大学团队发现VmGlu1缺失使毒素产量降低33%、致病力显著下降，揭示了植物病原真菌利用CWDEs突破宿主防御的新机制，为开发靶向杀菌剂提供理论依据。

　　

苹果树腐烂病是由Valsa mali引起的毁灭性病害，可导致树干溃烂甚至整树死亡，严重威胁苹果产业。病原菌通过分泌细胞壁降解酶(CWDEs)和毒素侵染宿主，但其突破苹果富含黄酮类化合物防御系统的机制尚不明确。前期研究发现β-葡萄糖苷酶VmGlu2可降解特征性黄酮根皮苷，但对另一种关键黄酮芦丁的降解效率较低，这为揭示病原菌的致病机制留下了重要空白。

青岛农业大学植物健康与医学学院的研究团队在《Phytopathology Research》发表研究，发现另一个β-葡萄糖苷酶VmGlu1可特异性降解芦丁，其表达在芦丁诱导下提升9.42倍。通过构建基因敲除和过表达菌株，结合酶活测定和毒素分析，系统解析了VmGlu1在Valsa mali致病过程中的多重功能。

研究采用的主要技术方法包括：1）基因敲除和互补菌株构建（使用PEG介导的原生质体转化）；2）表型分析（生长速率、分生孢子器计数）；3）致病力测定（苹果枝条和离体叶片接种）；4）酶活检测（DNS法测定β-葡萄糖苷酶活性）；5）代谢产物分析（HPLC定量毒素3-羟基苯甲酸和原儿茶酸）。

研究结果首先通过表达谱分析发现，芦丁处理使VmGlu1表达量提升9.42倍，显著高于VmGlu2的2.83倍。过表达菌株在含0.2%水杨苷培养基中生长加快，苹果叶片和枝条病斑分别扩大93.2%和39.3%，证实VmGlu1增强致病力。

在发育调控方面，ΔVmGlu1突变体的分生孢子器产量骤降99.32%，双敲除菌株ΔΔVmGlu2/VmGlu1几乎完全丧失产孢能力，表明VmGlu1是繁殖体形成的关键因子。但突变体营养生长不受影响，显示该基因功能特异性。

底物偏好性实验揭示VmGlu1对芦丁的初始降解速率是VmGlu2的8.66倍，而VmGlu2更擅长降解根皮苷。纯化蛋白实验证实，VmGlu1在48小时内降解80%芦丁，而点突变体（E248D/E473D）几乎丧失酶活，证明这两个保守催化残基的关键作用。

致病力分析显示ΔVmGlu1在苹果叶片和枝条上的病斑分别减小38.24%和43.28%，双敲除菌株病斑进一步缩小65.29%和70.21%。酶活检测发现突变体β-葡萄糖苷酶活性下降34.57%，且毒素3-羟基苯甲酸和原儿茶酸产量分别降低19%和35%，说明VmGlu1通过双重机制增强致病性。

研究结论阐明VmGlu1是首个被报道能特异性降解芦丁的植物病原真菌CWDEs，其通过三方面机制调控Valsa mali的致病过程：1）优先降解防御性黄酮芦丁；2）调控分生孢子器形成；3）影响毒素合成。与VmGlu2的功能冗余提示β-葡萄糖苷酶家族协同作用突破宿主防御。该发现不仅解析了苹果树腐烂病的分子机制，还为开发靶向黄酮降解通路的新型杀菌剂提供了理论依据，对保障苹果产业可持续发展具有重要意义。