MELK—— 肝癌射频消融治疗的关键靶点：开启增强疗效与抗癌新征程

本文聚焦肝癌（HCC）的射频消融（RFA）治疗，发现 MELK 通过稳定 FABP5 阻碍 RFA 诱导的免疫原性细胞死亡及抗肿瘤免疫反应。靶向 MELK 的 RGD - LNPs 可增强 RFA 疗效，为改善 HCC 临床治疗提供新方向。

　　### 背景
原发性肝癌是消化系统常见恶性肿瘤，肝细胞癌（HCC）占近 90%。射频消融（RFA）是治疗肝癌有前景的技术，能通过热效应杀死肿瘤细胞，还可激活免疫系统产生 “远隔效应”，但存在疗效不持久、易复发的问题。免疫原性细胞死亡（ICD）可引发针对肿瘤细胞抗原的免疫反应，RFA 可通过诱导 ICD 激活免疫系统，这被认为是产生抗肿瘤反应的关键。

母体胚胎亮氨酸拉链激酶（MELK）参与多种生理病理过程，在多种癌症中高表达，与癌细胞增殖、存活密切相关，在肝癌组织中也呈高表达，不过其对肝癌 RFA 治疗及免疫微环境的影响尚不明确。脂肪酸结合蛋白 5（FABP5）参与脂肪酸代谢，在癌症进展中起重要作用，与肝癌预后不良相关，但其在 RFA 介导的 ICD 和免疫激活中的作用也不清楚。因此，探究 RFA 耐药的调控机制，开发新的治疗策略迫在眉睫。

材料和方法

1. 动物模型：选用 6 - 8 周龄的 C57BL/6 和裸鼠，构建皮下荷瘤和原位肝癌模型，当肿瘤达到一定大小后进行 RFA 处理。
2. 差异表达基因（DEGs）和富集分析：从公开数据库下载 HCC 患者 mRNA 测序数据和临床信息，对 RFA 处理和假手术处理的动物模型肿瘤组织进行测序，分析 DEGs，并进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。
3. 免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）：对 HCC 肿瘤组织切片进行处理，分别用于 IF 和 IHC 检测，通过特定方法计算 IHC 评分。
4. 细胞培养和细胞热疗：培养多种细胞系，对肝癌细胞进行 47℃水浴加热 10min 模拟体外热消融。
5. 流式细胞术：制备细胞悬液，加入抗体，用流式细胞仪检测，区分不同细胞状态和细胞群。
6. 短发夹 RNA（shRNA）构建：从 Sigma - Aldrich 网站下载 MELK 特异性序列构建 shRNA。
7. 蛋白质 - 蛋白质相互作用对接模型：以 FABP5 和 MELK 为对象进行蛋白质对接。
8. 纳米材料制备：采用快速混合技术制备脂质纳米颗粒（LNPs），将靶向 MELK 的 siRNA（siMELK）等插入 LNPs，用透射电子显微镜（TEM）监测其质量。
9. 统计分析：实验独立重复 3 次，定量数据以均值 ± 标准误表示，用 t 检验或方差分析比较差异。

结果

1. RFA 促进小鼠肝癌组织免疫细胞浸润：构建小鼠消融模型发现，RFA 抑制 HCC 肿瘤生长，与肿瘤微环境（TME）和肿瘤生长相关的信号通路富集，抑制肿瘤增殖和血管生成，促进肿瘤细胞凋亡，激活免疫系统，促进 M1 极化、抑制 M2 极化，发挥抗肿瘤作用。
2. MELK 在 RFA 治疗后的 HCC 组织中高表达，是 HCC 患者的独立危险因素：确定了 33 个常见 DEGs，其中 MELK 在 RFA 治疗后上调，在 HCC 组织中表达高于癌旁组织。高表达 MELK 的 HCC 患者生存时间缩短、复发率增加，MELK 是 HCC 预后不良的独立危险因素。
3. MELK 敲低增强 HCC 对热疗和 RFA 的敏感性：体外实验表明，加热或 MELK 敲低诱导肝癌细胞死亡、抑制细胞活力和增殖，联合处理效果更明显。体内实验显示，RFA 联合 MELK 敲低可降低肿瘤大小、体积和重量，抑制肿瘤增殖、迁移，促进凋亡，降低 p - STAT3 水平，提高 RFA 疗效。
4. MELK 敲低促进 RFA 诱导的肝癌细胞凋亡和免疫原性死亡：体外和动物模型实验均表明，RFA 或 MELK 敲低导致细胞凋亡，联合处理效果最佳。同时，二者还诱导 ICD，联合处理使 Calreticulin（CALR/CRT）和 HMGB1 表达上调更明显，增强对肿瘤细胞生长的抑制作用。
5. MELK 敲低增强 RFA 诱导的 HCC 抗肿瘤免疫效应：构建异种移植瘤模型发现，MELK 或 RFA 单独处理抑制肝肿瘤进展，联合处理效果增强。MELK 敲低联合 RFA 抑制肿瘤相关巨噬细胞（TAM）浸润，增加 M1 巨噬细胞、减少 M2 巨噬细胞，增加 CD8⁺T 细胞浸润，改变细胞因子分泌，诱导抗肿瘤免疫激活。构建原位肝肿瘤模型进一步证实，联合处理对原位 HCC 进展抑制作用更强。
6. 肿瘤细胞内的 MELK 增强 PI3K/Akt/mTOR 信号轴，并与 FABP5 相互作用：对 MELK 敲低和热处理的肝癌细胞进行 RNA 序列分析，发现相关 DEGs 富集在细胞死亡、免疫反应和肿瘤信号转导相关通路。Western blotting 检测显示，MELK 敲低联合热处理降低 PI3K/Akt/mTOR 信号通路关键蛋白的磷酸化水平。分析发现 FABP5 是与 MELK 相互作用的关键蛋白，二者相互作用可能调节下游信号，影响肝癌细胞对热疗的敏感性。
7. MELK 降低 FABP5 的泛素化（Ub）水平以维持其稳定性：构建截断的 MELK 结构发现，MELK 的蛋白激酶结构域（PKD）与 FABP5 结合。MELK 敲低降低 FABP5 蛋白水平，不影响其 mRNA 水平。研究表明，MELK 通过调节 K48 Ub 影响 FABP5 稳定性，稳定 FABP5 蛋白表达，促进 PI3K/Akt/mTOR 信号通路。
8. FABP5 对 RFA 和 MELK 敲低的抗肿瘤作用至关重要：分析临床数据库和样本发现，肝癌患者中 FABP5 高表达，与预后不良相关，且与巨噬细胞浸润，尤其是 M2 巨噬细胞相关。体内实验显示，FABP5 敲低与 MELK 敲低的肿瘤抑制效果相似，RFA 治疗后 FABP5 表达上调，FABP5 过表达可抵消 MELK 敲低导致的细胞死亡和细胞活力下降，表明 FABP5 对调节 RFA 疗效及二者的抗肿瘤作用至关重要。
9. RGD - MELK - siRNAs 脂质纳米颗粒的合成与验证：制备 RGD 修饰的靶向 MELK 的 LNPs（RGD - LNP - siMELK - Cy5.5），TEM 显示其质量稳定，凝胶延迟实验表明 siRNA 能充分结合到 LNPs 中，且在 pH 6.0 时释放更好。体外实验显示，肝癌细胞对其摄取能力强，其 MELK 敲低效率和抑制肿瘤细胞增殖活力的效果优于裸 siRNA。
10. 靶向肿瘤细胞内 MELK 的 LNPs 增强 RFA 诱导的 HCC 抗肿瘤免疫效应：体内实验表明，LNPs - siMELK 抑制肝癌细胞活力，联合 RFA 对肿瘤生长抑制作用更强。检测发现，联合处理降低 TAM 比例，增加 M1 巨噬细胞，减少 M2 巨噬细胞，增加免疫激活相关的 GZMA⁺CD8⁺T 细胞，促进免疫激活相关细胞因子分泌，且该处理生物安全性高。

讨论

RFA 是肝癌重要治疗手段，但存在 “热沉降效应” 和免疫反应持续时间短等问题，导致癌症复发和进展。本研究发现 MELK 在 RFA 治疗后表达升高，与肝癌患者预后不良相关。MELK 敲低通过诱导凋亡和 ICD 抑制肝癌细胞生长等，联合 RFA 可增强抗肿瘤效果。

MELK 还影响巨噬细胞极化，MELK 敲低促进巨噬细胞 M1 极化，抑制 TAM 浸润和 M2 极化，间接影响 CD8⁺T 细胞，增强 RFA 诱导的免疫效应。FABP5 在肝癌组织和 RFA 处理后的动物模型中表达升高，与不良预后相关。MELK 通过与 FABP5 相互作用稳定其蛋白水平，激活 PI3K/Akt/mTOR 信号通路。FABP5 对 RFA 和 MELK 敲低诱导的 ICD 及抗肿瘤免疫反应至关重要。不过，由于肿瘤异质性，MELK 敲低联合 RFA 治疗对所有患者的有效性仍需进一步探索。

结论

高 TAM 浸润和高 MELK 表达促进肝癌 RFA 治疗后复发。本研究设计了一种纳米药物 LNPs - siMELK，可增强 RFA 的肿瘤杀伤作用，促进肿瘤免疫微环境重塑，动物实验显示其具有更高肿瘤靶向性和更长疗效，为肝癌精准治疗提供了新理论依据。