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脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种常染色体隐性神经肌肉疾病，现有基因检测方法存在局限。东京女子医科大学研究人员开展对临床诊断为 SMA 患者的 SMN1基因区域基因组分析，发现新突变和杂交基因，强调全长测序对 SMA 诊断的重要性。
脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一种令人揪心的常染色体隐性神经肌肉疾病，就像隐藏在身体里的 “恶魔”，悄无声息地破坏着患者的健康。它主要表现为肌肉无力和萎缩，是导致婴儿死亡的重要遗传病因之一。在全球，大约每 10000 个活产婴儿中就有 1 例发病，在日本，这一比例约为 1/20000。
SMA 根据发病年龄和疾病严重程度可分为不同亚型。1 型最为严重，患者在 6 个月前就会出现临床症状，甚至需要借助呼吸机维持生命；2 型患者在 18 个月前发病，虽然能独坐，但无法独立站立或行走；3 型患者发病于 18 个月之后，疾病进展会让他们逐渐失去行走能力；4 型则是成年发病，通常在 30 岁之后。
从基因角度来看，大多数 SMA 患者的 5 号染色体 q13 区域的生存运动神经元 1（Survival Motor Neuron 1，SMN1）基因存在纯合子基因缺失或功能丧失突变。而与之高度同源的 SMN2基因，虽然也能编码 SMN 蛋白，但由于外显子 7 的 840C>T 核苷酸差异，影响了剪接模式，产生的转录本缺少外显子 7，编码的是无功能的 SMN 蛋白。SMN2基因拷贝数与疾病严重程度相关，拷贝数越多，病情相对越轻。
近年来，随着 SMA 疾病修饰疗法的出现，基因检测变得愈发重要。然而，目前临床常用的多重连接依赖探针扩增（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA）方法只能检测 SMN1基因的拷贝数变异，无法捕获外显子和内含子内的基因变异，导致部分临床诊断为 SMA 的患者无法通过该方法进行基因确诊。为了突破这一困境，东京女子医科大学的研究人员开展了一项重要研究。
研究人员进行了一项回顾性观察研究，使用预先收集的临床确诊 SMA 患者的 DNA 样本。他们修改了长程聚合酶链反应（Long-range Polymerase Chain Reaction，LR-PCR）方法的引物，使其能够进行下一代测序（Next-generation Sequencing，NGS），从而对 SMN1基因的所有外显子和内含子进行分析，旨在明确 SMA 的基因诊断，并识别可能具有临床影响的单核苷酸变异（Single Nucleotide Variant，SNV）。
在研究过程中，研究人员从最初的 336 份 DNA 样本中，排除了 158 份 SMN1外显子 8 拷贝数为 0 的样本，因为这些样本不适合使用 LR-PCR 方法。最终，62 份样本被纳入研究。
患者特征：研究队列包括成人和儿童患者，涵盖 SMA 的 1 - 4 型。半数患者的最大运动功能是爬楼梯，部分患者还进行了气管切开术。在 SMN1外显子 7 拷贝数方面，7 名患者为 0 拷贝，7 名患者为 1 拷贝。
SMA 的基因诊断：通过 MLPA 分析 SMN 基因拷贝数后，对 62 份样本进行测序分析。两名女性患者被确定存在致病突变，从而得到基因诊断。一名 9 岁患者，1 岁时进行了气管切开术，3 岁时进行了胃造瘘和胃底折叠术，其 SMN1外显子 7 和 8 各有 1 拷贝，SMN2外显子 7 和 8 各有 2 拷贝，测序发现 SMN1内含子 6 存在杂合突变（c.835 - 3C>A）。另一名 56 岁患者，12 岁出现左脚肌肉无力，30 岁需要拐杖辅助行走，45 岁依赖轮椅，家族中有近亲结婚史，其 SMN1和 SMN2外显子 7 和 8 均为 2 拷贝，测序发现外显子 3 存在新的纯合错义突变（c.284G>A；p.G95E）。
改良 LR-PCR 扩增方法：对 13 份 DNA 样本进行改良 LR-PCR，成功扩增出包含 SMN1外显子 1 - 8 的 28.2kb 区域。NGS 分析显示，从外显子 1 到内含子 1 有良好的覆盖度，并检测到内含子 1 中以前未知的 SNV。
SMN1 SNV 分析：在 62 份样本中，在 SMN1内含子 6 中鉴定出 3 个感兴趣的 SNV，分别为 c.835 - 367C>A（n = 5）、c.834 + 1751G>A（n = 2）、c.834 + 1506A>G（n = 9）。其中，c.835 - 367C>A 和 c.834 + 1506A>G 在 SMN1外显子 7 拷贝数为 0 的患者中出现频率显著更高。
杂交 SMN 分析：对 5 名 SMN1外显子 7 纯合缺失但外显子 8 未缺失的患者进行杂交 SMN 基因检测，确认了一种新的杂交 SMN 基因类型，其序列为 taaTggG，由 SMN1的上游 “t” 和下游 “G” 序列以及 SMN2的 “aaTgg” 序列组成。
研究结果表明，目前用于 SMA 基因诊断的 MLPA 方法无法检测所有 SMN 基因变异，需要额外的方法来实现准确的基因诊断。研究中发现的新突变和杂交基因，为理解 SMA 的发病机制提供了新的视角。此外，研究还强调了全长测序对于 SMA 诊断的重要性，尤其是在新生儿筛查日益普及的今天，开发能够补充 MLPA 方法的 SMN 测序技术至关重要。
不过，该研究也存在一定局限性。由于 SMN1外显子 8 引物设计的原因，SMN1外显子 8 缺失的病例被排除在分析之外，只能分析外显子 7 缺失的轻度病例。而且研究队列较小，且仅包含日本患者，结果是否适用于其他人群还需要进一步研究确认。但这并不影响该研究为 SMA 研究领域带来的重要价值，它为后续研究指明了方向，有望推动 SMA 诊断和治疗的进一步发展。**
研究人员在开展研究时，主要运用了以下关键技术方法：首先，采用 MLPA 方法对预先收集的基因组 DNA 样本进行初步分析，检测 SMN1和 SMN2基因的拷贝数及缺失情况；接着，使用改良的 LR-PCR 方法，以 KOD FX Neo 聚合酶特异性扩增 SMN1基因包含外显子 1 - 8 的 28.2kb 区域；最后，对纯化的 LR-PCR 产物进行 NGS 测序，并利用相关软件进行变异注释和筛选。样本来源于东京女子医科大学临床确诊为 SMA 且提供了书面知情同意的患者。<
