含特异性结合 EtCab 蛋白噬菌体肽的海藻酸钠水凝胶对柔嫩艾美耳球虫感染的抑制作用及潜在应用价值

为解决抗球虫药物耐药性和疫苗安全性问题，东北农业大学研究人员开展 “含特异性结合 EtCab 蛋白噬菌体肽的海藻酸钠水凝胶对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）感染抑制作用” 研究。结果显示特定噬菌体肽可抑制虫体入侵，海藻酸钠包封效果更佳。该研究为开发抗球虫小分子药物提供参考。

　　在养鸡产业中，有一种 “隐形杀手” 严重威胁着鸡群的健康，它就是由原生动物艾美耳球虫（Eimeria）引起的鸡球虫病。这些球虫会悄无声息地侵入鸡的肠道上皮细胞，引发急性肠炎和组织坏死。患病的鸡会出现腹泻、脱水、体重减轻等症状，给全球家禽养殖业带来巨大的经济损失。

长期以来，人们主要依靠抗球虫药物来防治鸡球虫病，但随着时间推移，耐药性问题日益严重，这就像一场无休止的 “军备竞赛”，药物逐渐失去效果。同时，药物残留还可能影响食品安全，威胁人类健康。而活减毒疫苗也存在隐患，大规模感染时，减毒疫苗可能会恢复毒力，导致疾病爆发。因此，研发新型、安全且经济有效的预防措施迫在眉睫。

在这样的背景下，东北农业大学的研究人员挺身而出，开展了一项极具意义的研究。他们将目光聚焦在柔嫩艾美耳球虫的钙离子结合蛋白（EtCab）上，试图通过噬菌体展示技术筛选出能特异性结合 EtCab 蛋白的噬菌体肽，并探究这些肽对球虫感染的抑制作用。该研究成果发表在《Veterinary Research》杂志上。

研究人员在这项研究中用到了几个关键技术方法：首先是噬菌体展示技术（phage display technology），利用该技术筛选出与 EtCab 蛋白特异性结合的噬菌体；其次是间接免疫荧光测定（IFA）和蛋白质免疫印迹（Western blot），用于检测抗 EtCab 蛋白多克隆抗体的特异性；此外，还运用了分子对接（molecular docking）和同源建模（homologous modelling）技术，来分析目标肽与 EtCab 蛋白的结合机制 。

下面来看具体的研究结果：

1. 抗 EtCab 蛋白多克隆抗体的特性：制备的抗 EtCab 蛋白多克隆抗体效价为 1:2¹⁶，Western blot 和 IFA 检测表明，该抗体能特异性识别天然 EtCab 蛋白。
2. 噬菌体筛选及结合能力检测：经过四轮亲和筛选，获得了能与 EtCab 蛋白结合的阳性噬菌体。ELISA 检测发现，筛选出的 30 个噬菌体与 EtCab 蛋白的结合能力显著高于空白对照和阴性对照。其中，Y、G、V 三种噬菌体对应的肽序列结合能力最强，被选用于后续实验。
3. 体外抑制子孢子入侵细胞实验：荧光显微镜和流式细胞术检测显示，CFDA-SE 标记的子孢子能有效入侵 MDBK 细胞，且体外培养时间越长，入侵率越低。合成的亲和肽 Y、G、V 对 MDBK 细胞的最大无毒浓度为 125μg/mL，三种肽均能剂量依赖性地抑制子孢子入侵，Y 和 G 肽的抑制效果显著优于 V 肽。
4. 包封噬菌体的释放和分布：海藻酸钠微球对噬菌体的包封效率达 97.47±4.62%，在模拟胃液中，包封的噬菌体比游离噬菌体更稳定；在模拟肠液中，包封的噬菌体能够逐渐释放。口服给药后，包封的噬菌体在鸡消化道内的分布更合理，能在肠道内长时间维持较高滴度。
5. 体内抗球虫效果评估：感染柔嫩艾美耳球虫子孢子后，口服包封噬菌体的鸡体重增加明显高于感染对照组，且包封噬菌体组的卵囊减少率更高，盲肠病变评分更低。组织病理学检查发现，包封噬菌体组的盲肠组织损伤程度较轻。
6. 目标肽与 EtCab 蛋白结合机制分析：通过 ProtParam、SOPMA、I-Tasser 等软件分析 EtCab 蛋白结构，分子对接结果表明，Y、G、V 肽均能通过氢键与 EtCab 蛋白结合，Y 肽结合强度最高。序列分析还发现，Lys¹⁷⁴和 Asp¹⁷⁵是 Y 和 G 肽在不同艾美耳球虫物种中的保守结合位点。

综合研究结论和讨论部分，这项研究意义重大。研究证实了 EtCab 蛋白在球虫入侵宿主细胞过程中的关键作用，筛选出的特异性噬菌体肽能有效抑制子孢子入侵。海藻酸钠包封噬菌体的方式提高了噬菌体在体内的稳定性和有效性。分子对接分析揭示了目标肽与 EtCab 蛋白的结合机制，为理解球虫入侵机制提供了新视角。此外，研究发现的保守结合位点，暗示这些亲和噬菌体和肽可能具有更广泛的治疗潜力。总体而言，该研究为开发针对鸡球虫病的小分子药物提供了重要参考，有望为家禽养殖业的健康发展带来新的曙光。