RevCAR 介导的针对 PD-L1 阳性细胞的 T 细胞疗法：从免疫抑制到激活的变革

免疫疗法中的 CAR T 细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面成果显著，但应用于实体瘤治疗时，因免疫抑制性肿瘤微环境（TME）而面临挑战。研究人员开发 PD-L1 RevTM，结合 RevCAR 系统开展研究。结果显示该系统能有效杀伤 PD-L1 阳性肿瘤细胞，为实体瘤治疗带来新希望。

　　癌症作为全球第二大死因，严重威胁人类健康。传统的化疗和放疗在治疗癌症时，常常会给患者带来严重且持久的副作用。近年来，免疫疗法崭露头角，其中 CAR T 细胞疗法通过对患者 T 细胞进行基因改造，使其表达嵌合抗原受体（CARs），进而识别并杀死表达肿瘤相关抗原（TAAs）的细胞，在血液恶性肿瘤治疗中成绩斐然，已有多款 CAR 产品获批用于临床治疗。然而，CAR T 细胞疗法在应用于实体瘤治疗时却困难重重。实体瘤的免疫抑制性肿瘤微环境（TME）宛如一道坚固的屏障，阻碍 T 细胞的有效浸润、功能发挥和肿瘤细胞的清除 。同时，免疫检查点如程序性死亡配体 1（PD-L1）和细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4（CTLA-4）在肿瘤细胞及其微环境中常常过度表达，抑制免疫反应，这也使得免疫检查点阻断抗体治疗效果参差不齐，还容易引发耐药性和不良反应。此外，传统 CAR T 细胞疗法存在诸如脱靶效应和细胞因子释放综合征等风险，限制了其广泛应用 。为了解决这些难题，来自德国多个研究机构（Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf、TUD Dresden University of Technology 等）的研究人员开展了一项针对实体瘤治疗的重要研究。他们开发了一种新型的针对 PD-L1 的 RevTM（PD-L1 RevTM），并将其与 RevCAR 系统相结合，探索这种联合疗法在实体瘤治疗中的潜力。最终研究表明，该疗法能够有效靶向并杀死表达 PD-L1 的肿瘤细胞，为实体瘤治疗开辟了新的道路，研究成果发表在《npj Precision Oncology》杂志上。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。细胞模型构建方面，使用了多种细胞系（如 HT1080、PC-3 等）和患者来源的肿瘤球模型。功能检测技术上，通过流式细胞术评估蛋白结合能力和细胞表面抗原表达；采用基于荧光素酶的细胞毒性试验测定细胞杀伤效果；运用细胞因子释放试验检测细胞因子分泌情况；借助免疫组织化学染色研究细胞浸润和激活状态。动物实验模型上，建立了免疫缺陷小鼠的肿瘤异种移植模型，以此评估疗法的体内效果。

下面详细介绍研究结果：

1. PD-L1 RevTM 的设计与生产：研究人员设计的 PD-L1 RevTM 包含人 PD-1 蛋白的细胞外结构域（ECD）和抗 La（5B9）单链可变片段（scFv），通过短肽连接。将其克隆到慢病毒载体并转导至小鼠胚胎成纤维细胞系 3T3，经 Ni-NTA 亲和层析纯化，SDS-PAGE 和 Western blot 分析确认成功纯化 。
2. 结合评估与单层肿瘤细胞的特异性杀伤：通过流式细胞术检测多种细胞系的 PD-L1 表达，发现 PC-3 PSCA/PD-L1 细胞系高表达 PD-L1，PD-L1 RevTM 能与之特异性结合，对其他天然表达 PD-L1 的细胞系结合力较弱 。共培养实验表明，PD-L1 RevTM 能引导 RevCAR T 细胞有效杀伤 PD-L1 阳性肿瘤细胞，且在低效应细胞与靶细胞（E:T）比（1:2）下仍有较高杀伤效率，半最大效应浓度（EC₅₀）在低 pM 到低 nM 范围 。
3. RevCAR T 细胞的激活、分化和细胞因子释放：与 PD-L1 阳性靶细胞共培养后，RevCAR T 细胞显著分泌 GM-CSF、IFN-γ、TNF-α 和 IL-2 等促炎细胞因子。同时，CD69 表达增加，细胞亚群从幼稚和中央记忆 T 细胞向效应记忆和终末效应 T 细胞转变，表明 RevCAR T 细胞被特异性激活 。
4. RevCAR T 细胞在 PD-L1 表达球体中的特异性浸润和重定向：在 SCP-1 细胞系的 3D 球体模型中，PD-L1 RevTM 能诱导 RevCAR T 细胞浸润、杀伤球体，并释放促炎细胞因子。免疫组化分析显示，RevCAR T 细胞在球体中显著激活、增殖，且球体中 SCP-1 细胞的 PD-L1 表达上调 。
5. 新型 PD-L1 特异性 RevCAR 系统对患者来源肿瘤球体的杀伤作用：利用来自脂肪肉瘤患者的肿瘤球体模型（HLS1 和 HLS2）进行实验，发现 PD-L1 RevTM 能特异性杀伤 PD-L1 阳性的 HLS1 球体，并伴随促炎细胞因子分泌。而 HLS2 因 PD-L1 表达低，主要被 EGFR RevTM 杀伤 。
6. 使用双 RevCAR T 细胞对 PD-L1 和 PSCA 进行 AND-gated 靶向：为提高靶向特异性，研究人员构建双 RevCAR T 细胞，分别表达信号 CAR（SIG）和共刺激 CAR（COS）。在 PC-3 PSCA/PD-L1 细胞模型中，只有同时存在 PD-L1 RevTM 和 PSCA RevTM 时，双 RevCAR T 细胞才能完全激活，有效杀伤肿瘤细胞，并分泌促炎细胞因子 。
7. 通过 RevCAR 和双 RevCAR T 细胞系统在体内靶向 PD-L1：在免疫缺陷小鼠模型中，携带 PD-L1 RevTM 的 RevCAR T 细胞能显著抑制 HT1080 肿瘤细胞生长。双 RevCAR T 细胞联合 PD-L1 RevTM 和 PSCA RevTM，对 PC-3 PSCA/PD-L1 肿瘤细胞的杀伤效果显著优于单一 RevTM 。

研究结论与讨论部分指出，该研究成功开发了针对实体瘤中 PD-L1 的新型靶向策略。与传统免疫检查点阻断疗法不同，此方法直接靶向 PD-L1 阳性细胞，且具有可切换性，能将免疫抑制标记转化为 T 细胞激活标记 。RevCAR 系统可快速干预和控制 T 细胞杀伤活性，在多种复杂模型和实体瘤中均展现出良好效果 。同时，AND-gated 靶向策略提高了靶向特异性，减少脱靶效应 。然而，研究也存在一定局限性，如小鼠异种移植模型中 RevTM 半衰期短，限制了长期抗肿瘤研究 。总体而言，该研究表明 RevCAR 系统及其变体有望成为调节肿瘤微环境、精准靶向实体瘤中 PD-L1 的治疗平台，为未来实体瘤免疫治疗提供了新的方向和思路，具有重要的临床意义和潜在应用价值。