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这篇综述聚焦抗生素生物合成的代谢工程方法。随着多重耐药（MDR）细菌的出现，抗生素研发面临挑战。文中探讨了放线菌在抗生素发现和生产中的重要性，介绍了筛选新抗生素的方法，以及通过激活隐秘生物合成基因簇（BGCs）、工程改造菌株等提升抗生素产量和多样性的策略。
抗生素：人类健康的 “守护者” 与困境
抗生素，作为 20 世纪最具革命性的发现之一，极大地延长了人类的寿命。在青霉素被发现之前，传染病在全球范围内导致了极高的发病率和死亡率，当时人类的平均预期寿命仅约 47 岁。1347 - 1350 年，欧洲三分之一的人口因黑死病等大流行病而丧生。直到 20 世纪初，传染病仍占死亡率的 25%，是主要的死亡原因。1928 年，亚历山大?弗莱明偶然发现青霉菌的一种活性代谢物能抑制金黄色葡萄球菌的生长，这便是青霉素。此后，传染病的死亡率急剧下降至不到 1%，青霉素在二战中拯救了无数因感染而生命垂危的士兵。
自青霉素首次被发现以来，人们从自然界中发现了众多抗生素，它们拯救了无数感染患者的生命。抗生素种类繁多，可大致分为化学类、金属络合物类和肽类。化学类抗生素中的主要类别有 β - 内酰胺类、青霉素类、头孢菌素类、单环 β - 内酰胺类、四环素类和喹诺酮类等。同时，抗生素还可根据其作用机制（MoA）进行分类，包括抑制 DNA 复制、RNA 合成、蛋白质合成、细胞壁生物合成、细胞膜生物合成或脂肪酸合成等。不同的作用机制为发现新抗生素提供了重要线索。
然而，病原体的不断进化导致了抗生素耐药性的出现，尤其是在医院环境中，多重耐药（MDR）细菌的出现成为了严重的问题。据统计，全球至少有 127 万人因 MDR 细菌感染而死亡，2019 年更是有近 500 万人因此丧生。在美国，每年有超过 280 万患者受到 MDR 细菌感染。水平基因转移（HGT）是细菌获得抗生素耐药性的主要机制之一，一旦耐药基因出现，它们可以通过 HGT 迅速传播到其他细菌中。此外，由于新的耐药病原体迅速出现，抗生素产品的利润降低，制药公司减少了在抗生素研发方面的投资，导致新抗生素的开发速度放缓，近几十年来，天然抗生素的发现陷入了困境。
放线菌：抗生素的 “宝藏库”
土壤是一个充满微生物多样性的生态系统，其中放线菌是一类丝状革兰氏阳性细菌，在抗生素的发现和生产中发挥着至关重要的作用。许多目前使用的抗生素都是从放线菌中分离出来的，如 β - 内酰胺类、四环素类、利福霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类和糖肽类等。在 20 世纪 40 - 60 年代，从放线菌中发现了大量新抗生素，这一时期被称为 “抗生素发现的黄金时代”。尽管近年来从自然界中发现抗生素的速度有所下降，但放线菌基因组中仍蕴藏着巨大的潜力。
在众多放线菌菌株中，链霉菌属产生的抗生素最多。随着测序技术的进步，测序成本降低，人们能够分析更多链霉菌的基因组。例如，天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）、灰色链霉菌（Streptomyces griseus）和糖多孢红霉菌（Saccharopolyspora erythraea）的基因组中都含有超过 20 个编码次级代谢产物的生物合成基因簇（BGCs），这表明链霉菌具有复杂的代谢和调控途径，能够在不同的培养环境中产生多种次级代谢产物。新的能够产生新抗生素的链霉菌菌株仍在不断被发现，如最近发现的链霉菌 SM01 菌株。不过，放线菌在工业规模生产抗生素时面临着产量低、生产率低和产率低的挑战。
由于放线菌是多种抗生素的天然生产者，它们被广泛用于工业规模的抗生素生产。然而，由于放线菌基因组富含 GC 碱基对，且具有复杂的形态和生理特征，对其进行基因操作具有一定难度。相比之下，传统的模式微生物如大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），由于其代谢和调控途径不利于含有许多不相容遗传元件的大型 BGCs 的表达，也不适合用于异源生产抗生素。因此，一些具有良好特性的放线菌菌株被选作生产抗生素的底盘菌株，如天蓝色链霉菌 A3 (2)、白色链霉菌（Streptomyces albus）、阿维链霉菌 MA - 4680、白色链霉菌 J1074、变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）TK24 和委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）等。
白色链霉菌是最常用的用于异源表达各种 BGCs 的底盘菌株之一，其基因组较小，在引入异源 BGCs 时具有较高的遗传稳定性。通过对白色链霉菌进行大气和室温等离子体诱变结合核糖体工程，获得了盐霉素产量提高两倍的高产菌株。此外，白色链霉菌还可用于生产复杂的萜类化合物，尤其适用于萜类修饰的 P450 等修饰酶的功能表达。天蓝色链霉菌也是一种重要的底盘菌株，通过删除编码竞争性次级代谢产物的 BGCs，并对编码核糖体成分的基因进行突变，可提高目标化学品的产量。尽管对放线菌中的大型 BGCs 进行工程改造仍然具有挑战性，但新的合成生物学工具和策略正在不断发展，以促进这些强大宿主在工业规模抗生素生产中的应用。
探寻新抗生素：从传统到前沿的方法
在抗生素研发的早期，表型筛选是一种常用的方法。由于土壤中细菌种类繁多，但只有不到 1% 的细菌能够在实验室中成功培养，因此从众多天然产物中发现和鉴定抗生素并非易事。表型筛选是通过测试候选化学品对病原体活力的影响，基于其对生化活动或作用机制的可观察效应，在不知道靶点的情况下识别具有抗生素特性的化学品。
土壤微生物群落一直是抗生素发现的主要来源，近年来，人类微生物群落也受到了越来越多的关注，因为呼吸道容易受到病原体的侵袭。例如，通过对 90 株鼻腔葡萄球菌进行表型筛选，发现了一种非核糖体肽（NRP）抗生素鲁格敦菌素（lugdunin），它由人类鼻腔中的路邓葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）IVK28 产生，能够杀死代表性病原体金黄色葡萄球菌。
基于目标病原体活力的表型筛选无法提供抗生素候选物生化靶点的信息，因此抗菌活性筛选已从活力测试转向特定生化靶点抑制方法。当目标病原体（如结核分枝杆菌）由于生长缓慢和生物安全法规限制难以在实验室中测试时，可使用目标必需替代大肠杆菌（TESEC）平台。通过在大肠杆菌中删除一个必需基因，并替换为来自目标病原体的功能类似物，将细菌生长与目标酶的活性联系起来。在对结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶的 TESEC 平台进行高通量筛选时，发现了贝那普利是一种有效的抗结核抗生素。目前，表型筛选仍然被广泛用于发现新抗生素，并为新抗生素的作用机制提供见解。
确定抗生素的作用机制比单纯发现抗生素更具挑战性。抗生素的主要生化靶点包括细胞生存的必需元素、细胞壁和细胞膜合成、细胞膜通透性、电子传递、嘌呤和嘌呤核苷酸合成、DNA 合成和蛋白质合成等。以下介绍几种识别抗生素作用机制的方法。
细菌细胞学分析（BCP）是一种快速且强大的方法，可用于识别受抗生素影响的细胞途径，并区分影响不同细胞途径或同一途径中不同靶点的抑制剂。在 BCP 过程中，通过荧光染料染色方法对细菌进行可视化，如用 DAPI、SYTOX 和溴化乙锭（EtBr）进行 DNA 染色，用 FM4 - 64 进行细胞膜染色，用结晶紫和 Calcofluor white 进行细胞壁染色。例如，通过 BCP 发现抗生素肽 MciZ 可靶向枯草芽孢杆菌中的细胞分裂蛋白 FtsZ，用 MciZ 处理后，枯草芽孢杆菌细胞出现与 FtsZ 抑制剂处理后相似的表型，如细胞未分裂和 Z 环分布异常。通过 DAPI 染色的核仁长度变化可观察到 Z 环的缺失。
另一个例子是通过 BCP 阐明泛分析干扰化合物（PAINS）类似物的作用机制。用 PAINS 类似物处理细菌后，通过 BCP 观察到细胞壁合成和 DNA 复制受到抑制，这是由于抑制了胸苷酸激酶的活性，导致嘧啶 DNA 碱基合成受阻，表现为细胞丝状化和染色体复制缺陷。
流式细胞术是一种能够快速、准确分析单个微生物细胞的工具，即使这些细胞无法在实验室中培养。通过使用荧光标记，流式细胞术可分析细胞类型、活力和基因表达等多种化学和物理表型。例如，通过用荧光标记目标细菌来评估其活力，从而揭示拉帕醇二萜的作用机制。
流式细胞术还可通过使用 SYTO9（仅对活细胞染色）和 PI（仅对死细胞染色）来区分活细胞和死细胞。通过流式细胞术进行的活 / 死细胞检测可用于寻找不同抗生素的最佳组合，以增强抗菌性能。例如，抗菌肽 sphistin 和 sph12 - 38与阿奇霉素和利福平联合使用，可使代表性革兰氏阴性病原体铜绿假单胞菌的活力降低 85.93%。
成簇规律间隔短回文重复序列干扰（CRISPRi）利用催化失活的 Cas9 核酸内切酶，在单引导 RNA（sgRNAs）的引导下，特异性抑制目标基因的转录。通过在病原体中抑制抗生素靶基因候选物，可揭示抗生素的作用机制。由于靶基因大多是细菌中的必需基因，其表达降低会导致细胞活力大幅下降。例如，通过 CRISPRi 分析 peziculone 的作用机制，当敲低参与细胞壁合成（如 tagB 和 murB）、生物膜形成和必需代谢途径（如脂肪酸生物合成和蛋白质生物合成）的基因时，金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性增加。
另一个例子是通过 BCP 和 CRISPRi 确定 irresistin - 16（SCH - 79797 的衍生物）的靶基因。在枯草芽孢杆菌中敲低参与叶酸代谢的必需基因 dfrA（编码二氢叶酸还原酶）和 folC（编码二氢叶酸合酶）后，细胞活力对抗生素处理高度敏感。此外，通过 BCP 和流式细胞术证明 irresistin - 16 可破坏细胞膜完整性。综合多种方法可有效阐明抗生素的作用机制。
蛋白质组学是研究复杂蛋白质混合物的方法，如细菌裂解物或含有数千种蛋白质的临床组织样本。分析细菌蛋白质组的最基本方法之一是二维（2D）凝胶电泳，另一种方法是 iTRAQ，它通过对不同样本中蛋白酶解产生的肽段进行标记，每个样本连接不同的标签。通过 2D 凝胶电泳或 iTRAQ 发现的特定蛋白质，可随后通过液相色谱 - 质谱联用（LC - MS）或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI - TOF/MS）进行鉴定和定量，从而研究受抗生素处理影响的细胞途径。
例如，通过 2D 凝胶电泳和 MS 观察到鲍曼不动杆菌在接受舒巴坦抗生素处理后，细胞生存必需蛋白质（包括 ATP 结合盒（ABC）转运蛋白以及 30S 和 50S 核糖体亚基蛋白）的水平降低。通过 iTRAQ 研究乳酸杆菌酸处理后金黄色葡萄球菌的蛋白质组变化，经 LC - MS/MS 分析 iTRAQ 标记的肽段，揭示了细胞壁和细胞膜完整性的破坏、ABC 转运蛋白水平的改变以及细胞能量代谢的变化。蛋白质组学分析有助于深入了解新抗生素的作用机制。
激活隐秘基因：挖掘抗生素的新宝藏
许多未培养的细菌尚未得到充分研究，它们可能具有重要的价值，如参与元素循环或产生具有药用活性的天然产物。为了从自然界中挖掘未被探索的抗生素资源，需要尽可能重建自然栖息地来分离和培养这些细菌，这需要提供适宜的刺激，如温度、渗透压、宿主条件、化学诱导剂或前体，以及与周围其他细菌的特定相互作用。然而，即使精心调整培养环境，许多细菌仍然无法生长。
相邻细菌的影响和刺激是某些未培养细菌生长的重要因素。相邻细菌可通过提供可扩散的生长因子（如铁载体、环磷酸腺苷（cAMP）和酰基高丝氨酸内酯）或通过物理接触来刺激目标细菌的生长，但其具体机制仍有待进一步研究。因此，与来自相同环境的其他细菌共培养，可能使目标细菌在实验室条件下生长。
例如，海黄杆菌（Bacillus marisflavi）需要巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）产生的修饰酰基去铁氧胺铁载体作为生长因子，这有助于其利用氧化态铁作为必需营养素，有效调节细胞内稳态，从而促进生长。在另一项研究中，小单孢菌属（Micromonospora sp.）与红球菌属（Rhodococcus sp.）共培养产生了关键霉素（keycin），这是一种聚硝基糖基化蒽环类抗生素。蒽环类抗生素的骨架首先由小单孢菌属生物合成，然后由红球菌属修饰为苯并恶嗪，最终形成关键霉素。关键霉素具有独特的作用机制，但具体的抗菌机制仍不明确。真菌共培养也可产生新的化合物，如两种来自红树林的曲霉属真菌共培养可产生一种名为曲霉素（aspergicin）的新型化合物，它对变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有抗菌活性。
共培养也存在一些局限性，如培养辅助细菌的挑战、难以精确理解细菌间的相互作用以及确定合适的细菌共培养组合。为了解决这些问题，人们开发了分离芯片（iChip），这是一种多通道设备，通过半透膜将其分成多个部分，每个部分只能分离单个细胞。将 iChip 埋入土壤中，可在自然栖息地分离单个细菌细胞，然后在实验室中回收。通过 iChip 方法，从土壤样品中分离出的细菌比例显著提高到 50%。例如，通过 iChip 方法发现了由土壤杆菌（Eleftheria terrae）产生的新 NRP 抗生素替加环素（teixobactin），它对 MDR 革兰氏阳性病原体具有显著的杀菌活性，且至今未发现耐药性。有趣的是，从同一细菌物种土壤杆菌卡罗莱纳亚种中还发现了另一种新的 NRP 抗生素 clovibactin，它可阻断细胞壁生物合成，具有独特的结构和作用机制，也未出现耐药性迹象。
尽管人们努力培养 “未培养” 的细菌，但大多数仍然无法在实验室中回收。在这种情况下，宏基因组学可用于直接分析从环境样品中获得的大量基因组数据，而无需培养这些难以捉摸的微生物。测序技术的快速发展使得大量宏基因组数据得以积累，其中包含大量用于次级代谢产物生物合成的 BGCs。
例如，天蓝色链霉菌 A3 (2) 约有 7825 个基因参与超过 20 个 BGCs，海洋放线菌热带盐孢菌（Salinispora tropica）中鉴定出 17 个 BGCs，其中大多数是新颖的，包括负责产生聚烯大环内酰胺盐霉素 A（salinilactam A）的 BGCs。下一代测序（NGS）技术的发展，以及纳米孔测序和单细胞测序的进步，使得许多链霉菌菌株的基因组能够快速测序，从而发现了大量在正常培养条件下不表达的隐秘基因。在自然界中，这些隐秘基因仅在特定环境条件下被激活，以帮助宿主细胞在不同环境中生存。
为了从宏基因组数据中阐明隐秘基因和 BGCs，可使用宏基因组挖掘工具，如 MG - RAST、IMG/M、EBI Metagenomics、SILVAngs、MEGAN、QIIME 和 Mothur 等。例如，通过宏基因组分析预测编码聚酮合酶（PKS）和相关酶的基因，从而发现具有潜在抗菌特性的新聚酮化合物。antiSMASH（抗生素与次级代谢产物分析工具包）是目前最广泛使用的用于预测 BGCs 及其可能产物的生物信息学工具。
例如，使用 antiSMASH 预测球形链霉菌 SP6C4 中的隐秘 BGCs，该菌株常用于抑制植物病害。结果预测出 15 个 BGCs，其中一些被证明可产生具有抗菌活性的次级代谢产物，为农业应用提供了有价值的信息。antiSMASH 还可用于从大量数据库中全面筛选 BGCs。例如，对 GenBank 中所有高质量细菌基因组（截至 2014 年约 3000 个）进行分析，搜索编码 NRPS 的基因簇，预测出 96 种以前未鉴定的 NRPs，其中大多数是 C 末端环化肽。基于这些肽的共同结构特性，设计了 171 种合成肽，其中 9 种对 ESKAPE 病原体（包括粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌等主要 MDR 细菌）和结核分枝杆菌具有抗菌活性。此外，通过使用 antiSMASH 分析鼻腔共生细菌表皮葡萄球菌 IVK83 的基因组，分离出 BGCs，发现了一种 NRP - PK 杂合体 epifadin。还有其他宏基因组挖掘工具，如 BAGEL、PRISM、RiPPER 和 TOUCAN 等，这些方法使得无需直接培养细菌即可从宏基因组数据中发现新抗生素。
在阐明隐秘 BGCs 及其预测产物后，需要激活宿主菌株中的隐秘 BGCs，以生产、回收和分析产生的化学品。在天然宿主中激活 BGCs 的一种代表性方法是通过 CRISPR/Cas9 在 BGCs 前插入强组成型启动子（如 ermE和 kasO）。例如，在绿产色链霉菌（Streptomyces viridochromogenes）中，在编码 II 型聚酮合酶（PKS）的 BGC<
