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为解决酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在连续乙醇发酵中受高浓度乙醇抑制的问题，研究人员开展了对耐乙醇酿酒酵母菌株 ES-42 响应机制的研究。通过连续发酵和转录组分析，发现其随乙醇浓度变化的基因表达规律，为构建耐乙醇菌株提供依据。
在生物乙醇的工业生产领域，连续发酵技术就像一把双刃剑。它能大幅提高生产效率，降低成本，是工业生产的 “香饽饽”。可发酵过程中，微生物却要持续面对高浓度乙醇的 “攻击”。乙醇这一 “敌人” 会抑制细胞生长，限制发酵效率，还降低乙醇产量。为了突破这一困境，众多研究聚焦于微生物的乙醇耐受性，但以往大多基于实验室短期发酵研究，无法真实反映连续发酵中细胞长期面对高乙醇胁迫的情况 。
在这样的背景下，四川大学生命科学领域的研究人员勇敢地迎接挑战，开展了一项意义重大的研究。他们以耐乙醇的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株 ES-42 为研究对象，进行了为期两个月的连续乙醇发酵实验。最终，研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上，为该领域带来了新的曙光。
研究人员在研究中运用了多种关键技术方法。首先，构建了一阶段连续乙醇发酵系统，模拟工业生产环境。然后，利用比较转录组分析技术，在不同乙醇浓度下收集细胞，提取 RNA 进行测序，分析基因表达变化。通过这些技术，深入探究了 ES-42 对乙醇胁迫的响应机制。
下面来看看具体的研究结果。
- 连续乙醇发酵性能：实验过程分三个阶段，依据进料葡萄糖浓度划分。第一阶段，葡萄糖浓度 130g/L，随着发酵进行，乙醇浓度在 55.7 - 60.0g/L 波动后降至 58.3g/L，甘油浓度下降，提高通气率可增加细胞数量。第二阶段，葡萄糖浓度提升到 200g/L，乙醇浓度升至 73.7g/L，降低稀释率后达 86.9g/L，甘油浓度稳定但产量降低。第三阶段，葡萄糖浓度 260g/L，乙醇浓度先稳定在 80g/L，降低稀释率后升至 101.9g/L，甘油浓度和产量上升，增加氮源对乙醇浓度无影响。整个发酵过程中，细胞数量、存活率和出芽率随乙醇浓度升高而下降。
- 加权共表达网络构建与关键模块识别：在五个不同时间点（S1 - S5）提取 RNA，进行比较转录组分析。主成分分析（PCA）显示，随着乙醇浓度增加，样本差异更明显。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），确定了与乙醇和活细胞显著相关的蓝色模块，该模块包含 2105 个基因，其中 1756 个被确定为枢纽基因。
- 连续发酵过程中的动态基因表达景观：对 1756 个关键基因进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。结果显示，多个过程和通路被显著富集。翻译相关基因中，细胞质核糖体相关基因表达随乙醇浓度增加而下降，线粒体核糖体相关基因在 S2 表达升高。线粒体相关基因方面，氧化磷酸化和三羧酸循环（TCA cycle）关键酶基因在 S2 高表达。中央碳代谢相关基因，在不同阶段表达各异，TCA 循环、NADPH 和乙酰辅酶 A 合成相关基因在 S1 和 S2 高表达，糖酵解、甘油和乙醇合成相关基因在 S4 高表达。脂肪酸和麦角固醇合成相关基因，脂肪酸合成基因表达下降，麦角固醇合成基因先升后降。寿命调节通路相关基因，不同基因表达趋势不同，该通路可能在细胞应对乙醇胁迫中起关键作用。
研究结论表明，酿酒酵母菌株 ES-42 应对乙醇胁迫时，在低乙醇浓度下，激活呼吸作用提供能量，增强 NADPH、乙酰辅酶 A、麦角固醇和甘油合成来抵抗胁迫；在相对高浓度时，抑制呼吸，增加甘油合成，促进变性蛋白质的重折叠和降解。随着乙醇浓度升高，清除变性蛋白质对维持细胞功能和活力愈发关键。寿命调节通路在不同响应机制转换中可能发挥重要作用。
在讨论部分，研究人员将本次结果与以往研究对比。发现以往研究多关注短期乙醇暴露的转录变化，而此次研究聚焦长期暴露。在麦角固醇合成方面，本研究中该合成过程在 S2 增强后被抑制，可能是高乙醇浓度和能量、前体物质限制所致。同时，研究还发现蛋白质变性在长期和短期乙醇胁迫中均存在，本研究中热休克蛋白（HSPs）和泛素介导的降解相关基因持续上调，有助于清除变性蛋白，这或许是酵母细胞具有优秀乙醇耐受性的必要条件。此外，线粒体核糖体相关基因转录变化是本研究新发现，其在 S2 上调，后随乙醇浓度增加而抑制，这可能与呼吸产生的活性氧（ROS）损伤细胞有关。寿命调节通路在乙醇耐受性中的作用也值得进一步研究，该通路可能通过调节甘油合成增强细胞对乙醇的耐受性。研究还指出，寿命调节通路中的关键转录因子（TFs）可作为构建高乙醇耐受性酿酒酵母菌株的工程靶点。
这项研究为深入理解耐乙醇酵母细胞在连续乙醇发酵中的动态响应机制提供了宝贵信息，为构建更高效的耐乙醇酿酒酵母菌株奠定了理论基础，有望推动生物乙醇工业生产的进一步发展。
