编辑推荐：
本文聚焦 Cupriavidus necator（C. necator）在生物制造领域的应用。该菌是化能自养型细菌，能利用 CO2等生产化学品和生物塑料。文章探讨了其从通用菌转变为专用菌、优化自养代谢、开发可靠工具等方面的进展与挑战，为生物制造发展提供参考。
### 一、研究背景
化学工业对社会至关重要，但依赖不可再生资源且能源需求大，排放多。生物制造有望解决这些问题，利用微生物生产有价值产品。Cupriavidus necator H16 是一种革兰氏阴性化能自养型 β- 变形菌，其代谢适应性强，在生物制造领域极具潜力。本文旨在探讨 C. necator 在生物制造中的应用进展、面临的挑战，并提出基于其生理特性的优化策略。
二、从通用菌到专用菌的转变
C. necator 是兼性化能自养菌，能利用多种底物异养生长，也能通过卡尔文 - 本森 - 巴沙姆（Calvin-Benson-Basham，CBB）循环以 CO2为碳源自养生长。它可利用果糖、N - 乙酰葡糖胺等糖类，还能代谢多种有机酸和芳香化合物。自养生长时，它以氢气为能源，通过氢化酶氧化氢气获取电子，且拥有独特的 CO2浓缩机制，由 4 种碳酸酐酶样酶协助固定 CO2。此外，它还能利用甲酸作为碳源和能源，通过 4 种金属依赖型甲酸脱氢酶（FDH）实现，且该酶具有耐氧性。在厌氧条件下，C. necator 可进行反硝化作用，利用氧化态氮化合物作为末端电子受体。
然而，C. necator 的代谢通用性导致其在工业应用中效率受限。为使其成为高效的工业底盘菌，需进行基因组简化，减少不必要的蛋白质合成负担。研究发现，删除某些氢化酶相关基因和转录调节因子等可提高特定条件下的生长速率。同时，还需将聚 - 3 - 羟基丁酸（PHB）生产与营养限制解耦。PHB 是一种可生物降解的聚合物，其生产途径与生物制造相关，但天然情况下受营养限制诱导。通过调节相关基因，如过表达 sigma 因子 σ -54 等，可实现生长耦合的 PHB 生产，提高发酵过程的效率和生产力。
三、改善自养代谢
当前利用 C. necator 进行生物制造的研究多集中于 PHB 生产，因其途径内源性，简化了基因改造过程。但 C. necator 固定 CO2生产化学品的潜力不止于此，还可用于生产生物燃料、碳水化合物等。为满足工业生产需求，需提高其自养代谢能力。
微生物电合成（Microbial electrosynthesis，MES）是一种将电合成与微生物相结合的技术，C. necator 可在其中利用 H2作为电子载体，实现 CO2还原。在相关研究中，已利用工程化的 C. necator 在人工叶系统和标准 MES 系统中生产出异丙醇、α -humulene、PHB 等产品。然而，MES 面临着活性氧（ROS）毒性等问题，限制了系统的有效性。研究人员通过多种策略来解决这些问题，如调节电位、使用质子交换膜、添加抗氧化剂、物理分离发酵和电解过程等，但目前 MES 的产量、生产率和产率仍低于工业生产要求，需进一步优化电解和发酵过程。
除 MES 外，C. necator 利用 CO2进行气体发酵也是可持续生产增值产品的潜在策略。优化发酵条件可提高生产效率，如补料分批发酵可提高 PHB 生产率。此外，通过改变底物可控制产品类型，异养生长还可用于开发工程菌株，为后续自养生长做准备。
在自养发酵方面，研究人员对 C. necator 的碳固定途径进行优化。一方面，尝试引入替代碳固定途径，如还原甘氨酸途径（reductive glycine pathway，rGlyP），虽目前该途径的生长产量略低于野生型菌株使用 CBB 循环的产量，但有望通过进一步优化超越野生型。另一方面，对 CBB 循环进行工程改造，如过表达相关基因，可提高 C. necator 的生长速率和 PHB 产量。此外，通过适应性实验室进化（Adaptive laboratory evolution，ALE）和转录组数据分析，可筛选出有利于在特定底物上生长的突变株，进一步提高 C. necator 的生长和生产性能。通过这些优化，C. necator 可生产多种有价值的化学品，如丙酮酸、乙酰辅酶 A、1,3 - 丁二醇、巴豆酸、异亮氨酸、缬氨酸、白藜芦醇等。在生产过程中，还需考虑底物的选择，应优先选择可持续的底物，避免使用与食品生产竞争的糖类底物。
四、设计可靠的工具
随着 C. necator 底盘特异性工具的发展，对其进行工程改造以提高生长和生产性能变得更加可行。
在转化方法方面，传统的结合转化法效率低、耗时长。化学转化法虽相对简单，但在 C. necator 中的转化效率有待提高。电穿孔法是一种有效的转化方法，通过优化条件和改进质粒设计，可显著提高其转化效率。然而，C. necator 的限制修饰（RM）系统会影响电穿孔效率，不同研究中删除 RM 基因对转化效率的影响存在差异，且质粒的选择也会对结果产生影响，因此需要对用于工程改造 C. necator 的质粒进行标准化。
常用的工程改造 C. necator 的质粒为广宿主范围（BHR）质粒，但这些质粒缺乏标准化和模块化，转化效率低且稳定性差。pCAT 和 pMTL70000 载体系列质粒旨在克服这些问题，它们具有模块化设计，在复制、稳定性和转化效率等方面表现更优。
基因组工程对于菌株设计至关重要，C. necator 的基因组工程工具包括 Tn5 转座子、RalsTron、同源重组、CRISPR-Cas9 等。但这些工具存在效率低、操作慢等问题，如 CRISPR-Cas9 技术在整合大 DNA 序列时仍面临挑战。此外，底盘独立的重组酶辅助基因组工程（CRAGE）和 CIFR（Clone-Integrate–Flip-out–Repeat）等方法也在不断发展，为 C. necator 的基因组工程提供了更多选择。
在调控方面，诱导型启动子在工业应用中存在局限性，因此工程化组成型启动子更为相关。研究人员开发了多种组成型启动子文库，可扩大基因表达范围。同时，核糖体结合位点（RBS）文库也可用于调节基因表达，但需注意序列上下文对其活性的影响。CRISPRi（CRISPR interference）系统利用催化失活的 Cas9 酶（dCas9）实现对靶基因的转录抑制，可用于避免破坏细胞内代谢平衡，但因其代谢负担，在非必需基因的处理上，基因敲除更为合适，该系统在促进 ALE 等方面具有潜在价值。
ALE 是一种在受控环境中培养细胞，筛选有益突变的技术，可用于改善 C. necator 的某些特性。为克服细菌自发突变率低的问题，研究人员开发了 CRISPRi-Mutator 技术，可实现快速诱导基因组进化。
建模工具对于预测基因变化对 C. necator 代谢的影响至关重要，可辅助实验设计，加速代谢工程设计并节省实验耗材。基因组规模模型（Genome-scale models，GSM）是重要的建模工具，通过对 C. necator 基因组序列的分析构建，可预测代谢状态。目前已开发出多个 C. necator 的 GSM，如 RehMBEL1391 和 iCN1361，后者在反应平衡和预测准确性方面表现更优。通量平衡分析（Flux balance analysis，FBA）和资源平衡分析（Resource balance analysis，RBA）等方法基于 GSM 进行代谢通量和资源利用的分析，但这些方法也存在一定的局限性，如 FBA 仅考虑代谢化学计量，RBA 中部分蛋白质未被建模，表明 C. necator 的模型仍需进一步改进。
五、结论
合成生物学的目标之一是实现生物部件的标准化和模块化，C. necator 特异性工具的发展使其在生物制造中的应用更加可行。然而，C. necator 具有独特的生理特性，其合成生物学工具和方法应针对其自身特点进行开发。
C. necator 的代谢多功能性使其在生物制造中具有吸引力，但也增加了工程改造的难度。其大量未充分利用的蛋白质和非必需基因与环境适应性相关，但在受控培养条件下会限制生长速率。因此，需要深入了解其代谢灵活性的调控机制，以满足生物制造的需求。同时，开发超越现有约束、考虑动力学和热力学的模型，有助于优化 C. necator 的代谢工程策略。
在工程改造 C. necator 时，应充分发挥其自养生长的优势，从一开始就优化 CO2消耗，而不是先开发异养代谢再转换为自养代谢。进一步的菌株优化应聚焦于使其从通用代谢向自养条件下的高产转变，这可能需要进行基因组简化，减轻蛋白质负担，并将生产与营养限制解耦。对 C. necator 的持续探索研究将有助于开发更有效的工程策略，充分利用其独特特性，推动其在生物制造领域的工业化应用。
