Mcm5突变导致Stat1-bcl2沉默，加速DNA损伤的未成熟T淋巴细胞凋亡

　　

Mcm5 基因在 T 淋巴细胞发育中的关键作用研究解读

成都医学院基础医学院解剖学与组织学胚胎学系的研究人员 Min Liu 等人在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Mcm5 mutation leads to silencing of Stat1-bcl2 which accelerating apoptosis of immature T lymphocytes with DNA damage” 的论文。该研究揭示了 Mcm5 基因在 T 淋巴细胞发育过程中的重要调控机制，为理解 T 细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的发病机制以及寻找潜在治疗靶点提供了新的理论依据 ，对血液系统疾病研究和肿瘤防治具有重要意义。

一、研究背景

基因组不稳定是肿瘤发生的关键驱动因素，在 T 细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的发生、转移和进展中起重要作用。在肿瘤发生过程中，p16INK4A 缺失、微小染色体维持蛋白 MCM4/2 突变以及非同源末端连接（NHEJ）受损等导致的基因组不稳定，会与 MYC 协同作用，促进细胞增殖、驱动肿瘤发生。而高效清除基因组存在缺陷的淋巴细胞是预防淋巴细胞白血病的常见方式，因为抑制 p53 突变细胞的凋亡或过表达抗凋亡信号介质会促使白血病发生，包括 T-ALL。在 T 淋巴细胞发育过程中，基因突变（慢性 DNA 复制应激）导致 DNA 损伤后，未成熟淋巴细胞会敏感地发生细胞死亡，而存活的淋巴细胞在后期发育阶段可能进展为胸腺瘤。此外，DNA 损伤既可能源于内源性基因突变，也可能由短暂暴露于环境应激引起。机体需要进化出相应机制，区分基因突变诱导的慢性 DNA 损伤和短暂的 DNA 复制应激，从而清除严重且无法修复的 DNA 损伤淋巴细胞，维持基因组稳定并预防白血病。但目前这些机制尚未完全阐明。早期研究表明，MCM5 在 T 淋巴细胞白血病和早期 T 细胞发育中可能发挥关键作用，本研究聚焦于探究 Mcm5 在 T 细胞发育中的具体作用机制。

二、研究材料与方法

（一）实验动物及品系

使用野生型（AB，WT）动物以及多种转基因品系，如 Tg (c-myb:EGFP)、Tg (coro1a:EGFP) 等，在约 28.5°C 标准条件下饲养。Mcm5fl/fl 小鼠购自赛业生物科技有限公司，Mx1-cre 小鼠由赛业生物赠送。所有动物实验均获得成都医学院机构审查委员会批准，并在特定病原体 - free 条件下进行。

（二）基因编辑与载体构建

设计针对 mcm3 基因外显子 4 的 sgRNA，合成后与 Cas9 蛋白制备核糖核蛋白复合物（RNP），用于构建 mcm3 突变体。提取总 RNA 并制备 cDNA，通过 PCR 扩增目的基因（如 Δ113p53、bcl2a 等），克隆到相应载体（如 PCS2?、pcDNA3.1 等）中，用于后续实验。

（三）细胞分析实验

进行小鼠骨髓竞争性移植实验，将 Mcm5f/f;Mx1-Cre 和 WT 小鼠骨髓按 1:1 比例移植到致死性照射处理的受体小鼠中，使用聚肌苷酸聚胞苷酸（pI-pC）诱导 Mcm5 基因敲除，通过流式细胞术分析不同时间点受体小鼠外周血、造血干细胞 / 多能血液祖细胞（HSCs/MPPs）、常见淋巴细胞祖细胞（CLPs）和 T 系细胞等。同时，对斑马鱼胚胎进行化学处理（如用喜树碱、罗司维汀、阿非迪霉素等）、吗啉代寡核苷酸（MO）和 mRNA 注射，利用 RNA 测序（RNA-seq）、RT-qPCR、蛋白质免疫印迹（Western blotting）、免疫共沉淀（Co-IP）、免疫染色、EdU 掺入实验和细胞凋亡染色等技术，研究基因表达变化、蛋白质相互作用、细胞增殖和凋亡情况。

三、研究结果

（一）mcm5 调控 T 淋巴细胞成熟

MCM5 是 DNA 复制许可系统的关键组成部分，在斑马鱼中，mcm5 在包括造血干细胞和胸腺区域 T 细胞在内的所有增殖细胞中高表达。研究人员构建了 mcm5 突变体，发现其在原始造血阶段，HSC 标记物、红细胞标记物和髓系造血调节因子的表达未受影响，但在二次造血阶段，T 细胞标记物 rag1、il7r、ikaros 和 rag2 的表达在 5dpf 时缺失，且 rag2 表达在 4dpf 时显著下调。而过表达 mcm5 mRNA 或在 T 细胞中特异性表达 mcm5 能够挽救 T 细胞发育缺陷。这表明 mcm5 主要调控 T 细胞成熟，对 T 细胞发育早期事件影响有限。

（二）mcm5??胚胎中未成熟 T 细胞凋亡增加

在 mcm5 突变胚胎中，T 细胞在 4dpf 时显著减少，5dpf 时检测不到。研究人员利用 Tg (coro1a:GFP) 转基因胚胎研究 T 淋巴细胞发育过程，发现 3.5dpf 时，mcm5??胚胎与同胞胚胎中 coro1a:GFP 标记细胞数量无差异，但 4dpf 时，mcm5??胚胎中该细胞数量大幅减少，且更多细胞发生凋亡，细胞增殖延迟。通过热休克诱导 mcm5 表达或注射 mcm5 mRNA 可挽救这一表型，表明在 mcm5??胚胎中，未成熟 T 细胞从 3.5dpf 开始发生凋亡。

（三）Tp53 信号介导 mcm5 功能缺失导致的 T 细胞凋亡增加

对 mcm5 突变胚胎和同胞胚胎进行 RNA-seq 分析，发现 mcm5 突变胚胎中 378 个基因转录显著改变，其中与细胞周期、凋亡和 Tp53 信号相关的基因表达变化明显。进一步研究发现，在 mcm5??胚胎中，tp53 下游基因 Δ113p53 转录上调，虽然 tp53 转录水平未变，但 Tp53 蛋白表达和其下游基因转录增加。注射 tp53MO 可抑制未成熟淋巴细胞凋亡，显著恢复 T 淋巴细胞数量，证明 Tp53 信号上调介导了 mcm5 功能缺失后的 T 细胞凋亡。

（四）mcm5 突变体中未成熟 T 细胞对 DNA 损伤敏感性增加

MCM5 对启动 DNA 复制至关重要，mcm5 功能缺失会导致 DNA 复制缺陷和 DNA 损伤。研究发现，mcm5 突变体中 γ-H2AX 蛋白水平显著增加，表明存在 DNA 损伤。用喜树碱和罗司维汀处理斑马鱼胚胎诱导 DNA 损伤，发现处理后的胚胎 T 淋巴细胞数量减少，DNA 损伤更严重，TUNEL 阳性细胞增多，且 p53 下游基因上调，与 mcm5 突变体中的情况一致。但化学处理胚胎中未成熟 T 细胞数量在 4dpf 时比 mcm5 突变体多，说明 mcm5 突变体中未成熟 T 细胞对 DNA 损伤更为敏感。

（五）mcm5 突变体中 bcl2a 沉默加速未成熟 T 细胞凋亡

研究人员检测了化学处理胚胎和 mcm5 突变体中抗凋亡信号介质 Bcl2 和 Δ113p53 的水平，发现两者中 Δ113p53 表达均上调，但 bcl2a 在 mcm5 突变体中转录下调，在化学处理胚胎中上调。注射 bcl2a mRNA 可部分恢复 mcm5 突变体中 T 细胞数量，而在化学处理胚胎中敲除 bcl2a 则显著减少 T 淋巴细胞数量，表明 Bcl2 信号在 mcm5 突变体中无法有效增强，从而加速未成熟 T 细胞凋亡。

（六）stat1 信号下调介导 mcm5 突变体中 Bcl2 级联沉默

在 mcm5 突变体中，Stat1 信号通路相关基因表达下调，Stat1 磷酸化水平降低。注射 stat1a MO 进一步下调 bcl2a 和 rag1 表达，而注射 bcl2a mRNA 可部分恢复胚胎中 T 淋巴细胞发育。Co-IP 实验证明斑马鱼 Mcm5 与 Stat1a 相互结合，表明 Mcm5 直接与 Stat1a 相互作用并促进其磷酸化，调节 bcl2a 转录。mcm3 突变体中也出现类似 mcm5 突变体的 T 细胞发育缺陷，进一步支持了 Mcm5/Stat1 复合物对保护未成熟 T 细胞免受快速死亡的重要性。

（七）Mcm5 在小鼠 T 细胞成熟中的作用保守

小鼠 Mcm5 在 T 细胞成熟过程中表达增加，敲低 Mcm5 后，哺乳动物 293 T 细胞中 p-Stat1 水平显著降低。构建 Mcm5 条件性敲除小鼠并进行骨髓竞争性移植实验，结果显示，Mcm5 敲除后，外周血中 Mcm5??来源的白细胞数量持续减少，HSCs、CLPs 和所有类型的 T 系细胞数量均显著降低，其中 CD4?CD8?双阳性（DP）细胞对 Mcm5 敲除最为敏感，几乎消失。这表明 Mcm5 在小鼠 T 细胞成熟中的功能是保守的，且未成熟 T 细胞在造血过程中对 Mcm5 敲除更为敏感。

四、研究结论与讨论

本研究表明，在斑马鱼和小鼠中，Mcm5 在 T 淋巴细胞发育中起关键作用。Mcm5 突变导致未成熟 T 淋巴细胞 DNA 损伤，通过上调 Tp53 信号和下调 bcl2 转录，使未成熟 T 细胞发生凋亡。Mcm5 通过与 Stat1a 结合并促进其磷酸化，增强 bcl2a 表达，保护未成熟 T 细胞免受凋亡。在 mcm5 突变体中，Mcm5-Stat1 复合物缺失，降低了 Stat1 磷酸化和 bcl2a 转录，加速了基因组不稳定的未成熟 T 淋巴细胞凋亡。此外，Mcm5 在 T 细胞发育中的作用在小鼠中是保守的，尤其是对 CD4?CD8?DP 细胞的影响最为显著。

T 淋巴细胞在发育过程中对包括 DNA 复制应激在内的发育应激高度敏感，可能与 T 细胞受体（TCR）基因的 V (D) J 重排导致 T 细胞在应激下更易发生 DNA 损伤有关。Mcm5 功能缺失加剧了这种损伤，使未成熟 T 细胞更易凋亡。虽然本研究揭示了 Mcm5 在 T 细胞发育中的重要机制，但仍有一些问题有待进一步研究。例如，在小鼠中，Mcm5 敲除后剩余的 CD4?或 CD8?单阳性 T 细胞的来源和特性尚不明确；此外，尽管 bcl2a mRNA 注射部分挽救了 mcm5 突变体中的 T 细胞发育缺陷，但效果不完全，可能存在其他抗凋亡基因或 Tp53 蛋白持续上调等因素影响。

该研究不仅揭示了 Mcm5 在调节 T 细胞发育中的新作用，还为理解基因突变诱导 DNA 损伤的未成熟 T 细胞在 T 淋巴细胞发育过程中被快速清除的机制提供了重要依据，为血液系统疾病的研究和治疗开辟了新的方向，有助于未来开发针对 T-ALL 等疾病的更有效治疗策略。