通过基因组学和宏基因组学探索DNA原位降解和博物馆储存

来自西格陵兰因纽特人狩猎营地的考古驯鹿肋骨的DNA保存在新出土的样本中显示出更好的质量，揭示了博物馆储存和不同微生物群落参与骨骼降解的有害影响。

　　

探究考古骨骼 DNA 在不同环境下的降解与微生物群落作用：对博物馆藏品保存的启示

近期，丹麦国家博物馆环境考古与材料科学部门的研究人员安妮?玛丽?赫伊耶?埃里克森（Anne Marie H?ier Eriksen）等人，在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “Exploring DNA degradation in situ and in museum storage through genomics and metagenomics” 的论文。该研究通过对格陵兰岛出土驯鹿肋骨的分析，深入探讨了骨骼 DNA 在原位和博物馆存储条件下的降解情况，以及微生物群落对骨骼的影响，为理解考古骨骼 DNA 保存机制和优化博物馆藏品保存策略提供了重要依据。

一、研究背景

古代人类和动物的骨骼是珍贵且不可替代的资源，其中的生物分子如 DNA，能为研究进化关系、迁徙、健康状况以及农耕和狩猎方式等提供宝贵信息。然而，关于骨骼生物分子在博物馆收藏环境与原始埋藏环境中的保存差异，此前仅有少数研究进行过直接对比。例如，Burger 等人发现长期储存会降低骨骼材料的相对 DNA 含量和 DNA 扩增的可重复性；Pruvost 等人对比了一块 3200 年前欧洲野牛骨头在不同时间挖掘的线粒体 DNA 含量，得出在博物馆收藏的 57 年里，其 DNA 损失量相当于此前 3200 年在原位的损失；Allentoft 等人也指出储存时间对骨骼 DNA 保存有负面影响。随着分析技术和计算能力的进步，如今能够对骨骼生物分子进行更详细、复杂的分析，从而深化对骨骼 DNA 降解过程的理解。

动物死亡后，DNA 会在细胞自溶过程中开始降解，随后涉及多种复杂过程，包括氧化、水解和酶促（微生物）降解。水解反应会破坏 DNA 双链的基本结构，导致碱基脱氨，其中胞嘧啶脱氨常见，会在测序时产生错误。氧化反应则会产生阻碍 DNA 链延伸的损伤。此外，温度、pH 值、水和氧气的可利用性等物理因素对 DNA 成岩作用至关重要。同时，细菌对骨骼的生物侵蚀是骨骼沉积后降解的重要机制，微生物通过产生特殊酶来分解胶原蛋白和使羟基磷灰石脱矿化，但由于骨骼化学结构复杂，微生物降解骨骼可能需要多种酶协同作用。此前，在古代 DNA 研究背景下，对这一协同系统的详细研究较少。

二、研究材料与方法

（一）研究材料

研究样本来自格陵兰岛西部一处因纽特人夏季狩猎营地 Aasivissuit。1978 年和 2021 年，研究人员从该营地同一挖掘沟渠中采集了 33 根驯鹿（Rangifer tarandus）肋骨，其中 1978 年挖掘 17 根，2021 年挖掘 16 根。此外，2021 年还从挖掘现场不同深度采集了 9 份土壤样本，并在遗址外采集 1 份土壤样本作为自然参考。

（二）研究方法

1. 环境监测：在 2021 年挖掘期间，直接测量土壤剖面的 pH 值和含水量，利用传感器持续监测 2021 - 2023 年土壤的温度和含水量，采集土壤环样本分析孔隙度和空气含量，计算解冻度日数（TDD）。同时，获取挖掘现场附近机场的气候数据以及博物馆储存区域的温度和相对湿度数据。
2. DNA 采样、提取和测序：从每根肋骨上钻取约 70mg 骨粉，经 EDTA 预处理、离心、过滤纯化后，使用 PowerSoil DNA Isolation Kit 提取 DNA。提取过程中每十个样本设置一个提取空白对照。采用 Qubit TM dsDNA High Sensitivity DNA assay 定量 DNA 浓度，构建双索引 Illumina 文库，进行 qPCR 定量内源性 DNA，经质量控制后在 NovaSeq6000 平台测序。
3. 遗传数据分析：对原始测序文件进行去复用、修剪和合并处理，将处理后的序列比对到驯鹿核基因组，计算比对读长、核苷酸错配率和 DNA 片段化程度。同时，将读段比对到人类基因组以控制人类污染，分析提取空白样本的微生物含量以控制微生物污染。
4. 宏基因组组装：对样本原始读段进行拼接、去重等处理，使用 Anvi’o v7.1 和 Snakemake 管道分别对 1978 年和 2021 年样本进行共组装，生成高质量宏基因组组装基因组（MAGs）。对 MAGs 进行分类学注释、系统发育分析，计算其丰度和覆盖率，分析微生物多样性和差异丰度，筛选骨骼降解酶基因，评估微生物 DNA 损伤情况。
5. 骨组织学分析：从 10 根肋骨（各 5 根来自 1978 年和 2021 年挖掘样本）上取约 0.2g 子样本，嵌入环氧树脂后抛光至约 40μm 厚度，通过光学显微镜和扫描电子显微镜观察骨骼的微观结构变化，包括生物侵蚀、脱矿化等。

三、研究结果

（一）驯鹿 DNA 降解

1. DNA 含量差异：Qubit 测量显示，2021 年挖掘的骨骼总 DNA 浓度显著高于 1978 年博物馆储存的骨骼。qPCR 结果表明，1978 年样本中可 PCR 扩增的 mtDNA 含量低于 2021 年样本，2021 年样本中大于 140bp 的可扩增驯鹿 mtDNA 模板量约为 1978 年样本的 16 倍。
2. 片段长度与损伤差异：对映射到驯鹿参考基因组的序列分析发现，2021 年挖掘的骨骼平均片段长度长于 1978 年样本，且 1978 年样本的 DNA 片段化概率更高。虽然 2021 年挖掘骨骼的胞嘧啶脱氨率有高于 1978 年样本的趋势，但差异不显著，且总体损伤水平较低。

（二）比较 DNA 衰变与环境

遗址的埋藏环境具有缺氧和高含水量特征，理论上有利于考古骨骼和有机材料的保存。而博物馆干燥温暖的储存环境，虽理论上利于 DNA 保存，但研究结果显示，博物馆储存的骨骼 DNA 片段化可能性更高，映射到驯鹿参考基因组的片段更短。研究人员推测，博物馆储存环境中相对湿度变化、温度较高以及氧气可利用性增加，可能是导致 DNA 质量和数量差异的原因。

（三）微生物群落

1. 微生物多样性分析：初步分析发现，博物馆储存骨骼的微生物群落 α 多样性高于 2021 年挖掘的骨骼。基于层位的分析显示，2021 年挖掘骨骼的 α 多样性随层位下降，而博物馆储存骨骼各层 α 多样性保持较高水平。宏基因组共组装结果进一步证实了这一趋势。
2. 微生物群落组成差异：通过非度量多维缩放（NMDS）分析，发现骨骼微生物群落按年份聚类，土壤微生物群落介于两年挖掘骨骼之间且更接近 2021 年样本。对最丰富分类群的比较表明，2021 年挖掘骨骼的微生物群落更具土壤特征，而 1978 年骨骼的微生物群落更为多样。

（四）骨骼降解细菌酶：“降解组”

研究在所有骨骼样本的 MAGs 中均检测到参与骨骼降解过程的酶，但不同年份样本中降解酶的组成存在差异。例如，1978 年骨骼中具有周质丝氨酸蛋白酶活性的细菌显著更丰富，而 2021 年样本中肽酶 M9、周质 β - 葡萄糖苷酶等更普遍。土壤样本中骨骼降解的代谢潜力不如 2021 年挖掘的骨骼样本明显，表明检测到的酶谱具有骨骼特异性。

虽然组织学分析未发现明显生物侵蚀迹象，但部分样本存在扩大的骨细胞腔隙（OCL），这可能与早期细菌衰变有关。对 MAGs 的 DNA 损伤分析表明，博物馆样本中的细菌 DNA 损伤更严重，部分细菌家族如分枝杆菌科和链霉菌科在博物馆储存骨骼中降解更明显，而在 2021 年挖掘骨骼中更活跃。

四、研究结论与讨论

本研究通过对不同储存条件下驯鹿骨骼 DNA 和微生物群落的分析，得出以下重要结论：一是原位保存的骨骼 DNA 在质量和数量上均优于博物馆储存的骨骼，博物馆储存可能会降低未来生物分子研究的潜力；二是不同年份挖掘的骨骼微生物群落存在显著差异，新鲜挖掘骨骼的微生物群落与周围土壤不同，存在特定的骨骼栖息微生物，博物馆储存骨骼的微生物群落则是土壤微生物和储存过程中积累细菌的混合；三是博物馆储存条件可能加速骨骼 DNA 降解，为保存遗传物质，可考虑在挖掘时保留部分考古材料原位，但对于面临破坏威胁的遗址，这并非可行方案。

该研究具有多方面重要意义。在学术层面，进一步揭示了考古背景下基因组材料保存的复杂机制，为古代 DNA 研究提供了新的视角和数据支持，加深了对微生物在骨骼降解中作用的理解。在实践层面，研究结果为博物馆藏品管理提供了科学依据，强调了优化博物馆储存条件对保护珍贵骨骼记录的重要性，有助于制定更合理的博物馆藏品保存策略，以确保全球博物馆中大量骨骼遗骸能用于未来的遗传研究。未来，还需深入研究特定博物馆储存气候对骨骼 DNA 保存的具体影响，探索更有效的保存方法，平衡保存成本与效果，为考古学、生物学等多学科研究提供更好的支持。