单细胞RNA测序定义了不同的疾病亚型，并揭示了无症状华氏大球蛋白血症对干扰素的低反应性

肿瘤固有和免疫改变对Waldenstrom巨球蛋白血症（WM）患者疾病进展的影响仍有待研究。在这里，作者进行了单细胞rna测序，鉴定了WM患者不同的肿瘤亚型、肿瘤微环境特征和潜在的治疗脆弱性。

　　

单细胞 RNA 测序解析华氏巨球蛋白血症的疾病亚型及免疫机制

近日，来自丹娜法伯癌症研究院（Dana-Farber Cancer Institute）等多个机构的研究人员在《Nature Communications》杂志上发表了题为 “Single-cell RNA sequencing defines distinct disease subtypes and reveals hyporesponsiveness to interferon in asymptomatic Waldenstrom’s Macroglobulinemia” 的研究论文。该研究通过单细胞 RNA 测序等技术，深入剖析了华氏巨球蛋白血症（Waldenstrom’s Macroglobulinemia，WM）的肿瘤内在机制和免疫微环境变化，为 WM 的诊断、预后评估和治疗决策提供了重要依据，在血液肿瘤研究领域具有重要意义。

一、研究背景

WM 是一种罕见的非霍奇金淋巴瘤，主要特征为骨髓中分泌 IgM 的淋巴浆细胞增殖，在美国每年的发病率为百万分之 3.8。WM 通常由两种前驱疾病发展而来，即意义未明的单克隆 IgM 丙种球蛋白血症（IgM MGUS）和冒烟型 WM（SWM），这两种前驱疾病统称为无症状 WM（AWM）。目前，AWM 患者通常在病情进展为有症状的 WM 时才接受治疗，因此，明确哪些 AWM 患者具有更高的疾病进展风险，对于改善随访建议和指导风险适应性治疗至关重要。

此前的研究已确定了一些与 WM 疾病进展相关的因素，如骨髓浸润、血清 IgM 水平、β2 - 微球蛋白和白蛋白水平等，并且开发了预后模型对患者进行风险分层。然而，这些预测算法仅依赖临床变量，对于剖析疾病进展的生物学机制、确定影响患者预后和治疗选择的肿瘤内在和外在因素的研究仍有待深入。此外，尽管 MYD88 突变、CXCR4 突变和 6 号染色体长臂缺失（Del6q）等已被证明与 WM 的进展相关，但基因表达谱分析在确定与疾病进展相关的关键基因表达程序方面尚未得出明确结论，骨髓免疫微环境在调节 WM 疾病进展中的作用也知之甚少。

二、研究材料与方法

（一）研究对象

研究人员从 30 例 AWM/WM 患者、26 例冒烟型多发性骨髓瘤（Smoldering Multiple Myeloma，SMM）患者和 23 例健康供体（Healthy Donor，HD）中获取了骨髓肿瘤和免疫细胞样本。所有参与者均签署了知情同意书，研究也获得了相关机构审查委员会的批准。

（二）样本处理

骨髓抽吸物和外周血收集在 EDTA 管中，通过 ficoll 分离或红细胞裂解缓冲液分离出骨髓单核细胞（BMMCs）和外周血单核细胞（PBMCs）。BMMCs 根据制造商的说明进行 CD138 和 / 或 CD19 的磁珠富集，然后在含有 10% 二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FBS）中冷冻保存；PBMCs 则直接在含有 10% DMSO 的 FBS 中冷冻保存。

（三）关键技术路线

1. 单细胞 RNA 和 BCR 测序：对 18 例 IgM MGUS/SWM 患者和 4 例 WM 患者的 CD138 + 和 / 或 CD19 + 肿瘤细胞进行单细胞 RNA 和 BCR 测序，以分子特征化早期肿瘤；对 25 例 IgM MGUS/SWM 患者和 3 例 WM 患者的 CD138 和 / 或 CD19 - 免疫细胞进行单细胞 RNA 测序，以全面表征疾病进展过程中骨髓免疫微环境的变化。

2. 数据处理与分析：使用 CellRanger 对 FASTQ 文件进行解复用并生成计数矩阵，利用 R 和 Seurat 进行下游分析，包括环境 RNA 校正、 doublet 检测、归一化处理等。通过多种方法对细胞进行注释，并使用 Wilcoxon 秩和检验等统计方法比较不同组之间的细胞类型比例和基因表达差异。

3. 功能实验：进行体外刺激实验，用 I 型干扰素刺激来自 AWM 患者和 HD 的 CD138- BMMCs 和 PBMCs，检测 T 和 NK 细胞对干扰素刺激的反应；通过 ELISPOT 检测 PBMCs 刺激后的 IFN-γ 水平，评估 T 细胞的激活能力；使用流式细胞术检测 NK 细胞的细胞毒性。

三、研究结果

（一）免疫失调在 WM 病程早期即已存在

研究人员对 27 例患者的 28 个骨髓免疫细胞样本进行单细胞 RNA 测序，并整合 HD 和 SMM 患者的内部数据。结果显示，尽管 AWM 患者处于疾病早期，但骨髓免疫细胞组成已发生显著改变，包括 CD56dim NK 细胞、S100B+ CD56dim NK 细胞等多种细胞比例增加，而细胞因子表达的 CD14 + 单核细胞、浆细胞样树突状细胞（pDCs）等减少。IgM MGUS 患者虽无骨髓浸润的形态学证据，但部分免疫细胞比例已出现显著变化，表明免疫失调在疾病早期甚至早于骨髓浸润的形态学改变就已发生。此外，研究还发现 SWM 患者的调节性 T 细胞（Tregs）比例相较于 IgM MGUS 患者显著增加，提示 Tregs 可能在疾病进展中发挥作用。

（二）AWM 和 SMM 的疾病特异性免疫特征

通过比较 AWM 和 SMM 患者骨髓免疫微环境的组成差异，研究发现两种肿瘤类型患者的 S100B+ CD56dim NK 细胞和 CD16 + 单核细胞比例均显著增加，但 AWM 患者的增加更为明显。AWM 患者的活化和干扰素刺激的 T 和 NK 细胞显著少于 SMM 患者和 HD，而 SMM 患者的 CD14 + 单核细胞较少，Tregs 和幼稚 CD4 T 细胞较多。在基因表达水平上，SMM 患者髓样细胞中 CEBPD 表达降低，而 AWM 患者髓样细胞中 MNDA 表达增加。基于免疫细胞组成的主成分分析和支持向量机（SVM）分类器分析表明，免疫谱分析有可能用于诊断癌症，并区分 AWM 和 SMM。

（三）AWM 患者的 T 和 NK 细胞对干扰素刺激反应低下

针对 AWM 患者中干扰素刺激的 T 和 NK 细胞减少的现象，研究人员进行体外刺激实验。结果显示，AWM 患者的 T 和 NK 细胞对干扰素刺激的反应低于 HD，且这种缺陷是全身性的，虽可通过外源性干扰素部分纠正，但仍无法完全恢复正常。进一步研究发现，AWM 患者骨髓微环境中并不缺乏干扰素，且给予干扰素后，AWM 患者 NK 细胞的细胞毒性虽有所增加，但仍低于 HD。这表明 AWM 患者的 T 和 NK 细胞对干扰素刺激反应低下，且干扰素治疗可能是部分 WM 患者的潜在治疗靶点。

（四）单细胞 RNA 和 BCR 测序解析并发的淋巴样克隆

对 18 例 IgM MGUS/SWM 患者和 4 例 WM 患者的肿瘤细胞进行单细胞 RNA 和 BCR 测序，研究人员在 21 例样本中鉴定出 48,875 个 WM 肿瘤细胞。同时，研究发现部分患者存在并发的淋巴样克隆，如慢性淋巴细胞白血病（CLL）等，且部分患者为多克隆 WM。这些发现凸显了单细胞 RNA/BCR 测序在临床诊断中的鉴别能力。

（五）AWM 患者中边缘区样、IgE+、非典型和类别转换记忆 B 细胞的丰度增加

利用单细胞 BCR 测序，研究人员对 AWM 患者的正常 B 细胞进行分析，发现与 HD 相比，AWM 患者的正常 B 细胞向记忆 B 细胞转变，幼稚 B 细胞和活化 B 细胞减少，边缘区样 B 细胞、IgE + 记忆 B 细胞、非典型 B 细胞和类别转换记忆 B 细胞增加。这些变化可能与 WM 的疾病进展或肿瘤发生有关。

（六）单细胞 RNA 测序揭示 MYD88 突变型 WM 中未被认识的肿瘤间异质性

研究发现 WM 肿瘤细胞存在明显的异质性，CXCR4 突变状态虽能解释部分异质性，但 CXCR4 突变型肿瘤并不都聚集在一起。通过分析，研究人员发现 CXCR4 表达在 WM 肿瘤中可独立于 CXCR4 突变而被上调，且拷贝数变异（CNVs）也不能完全解释观察到的异质性，表明还有其他因素影响 WM 的转录景观。

（七）基于表达的 MYD88 突变型 WM 肿瘤分类揭示疾病亚型和与进展相关的表达特征

通过贝叶斯非负矩阵分解，研究人员从 WM 肿瘤细胞中提取了 8 个基因表达特征（GEX），去除两个与免疫细胞激活和单核细胞污染相关的特征后，对剩余 6 个特征进行分析。结果确定了 WM 肿瘤的多个亚型，包括 CXCR4 高表达子集、DUSP22/CD9 高表达子集等。不同亚型与疾病进展风险和临床特征相关，如 GEX-7 与骨髓浸润程度相关，GEX-5 与淋巴结病相关且可能与对伊布替尼的治疗反应有关。

（八）AWM 患者中反复失调的基因及其与进展的关联

通过对 WM 肿瘤细胞与正常记忆 B 细胞进行差异表达分析，研究人员鉴定出多个在 WM 肿瘤中频繁失调的基因，如 IGHM、CD79B 等。部分基因在 IgM MGUS 和 WM 患者之间存在显著差异表达，可能与疾病预后相关。

四、研究结论与讨论

本研究通过对 30 例 IgM MGUS/SWM/WM 患者、26 例 SMM 患者和 23 例 HD 的单细胞 RNA 测序，全面表征了 WM 的肿瘤转录组和免疫微环境。研究确定了 WM 的免疫特征和基因表达生物标志物，这些标志物对预后评估和治疗决策具有潜在意义。免疫失调在 AWM 患者中显著存在，且在无骨髓淋巴瘤浸润形态学证据时就已发生，免疫谱分析有望用于患者风险分层和早期治疗选择。此外，研究还揭示了 AWM 患者 T 和 NK 细胞对干扰素刺激反应低下的现象，这可能是部分患者的治疗靶点，新型 I 型干扰素制剂或可在 WM 治疗中发挥作用。

在肿瘤内在机制方面，研究定义了 WM 肿瘤的基因表达特征，这些特征可用于肿瘤亚分类，并与疾病进展风险相关。例如，GEX-7 可帮助识别高风险患者，GEX-5 与淋巴结病和对伊布替尼的治疗反应相关。这些发现为 WM 的临床分层和治疗选择提供了重要的分子依据。

总体而言，该研究全面描述了 AWM 患者的免疫失调类型，鉴定了疾病的免疫特征和疾病进展的生物标志物，揭示了患者 T 和 NK 细胞对干扰素刺激的全身性低反应性，以及 WM 肿瘤的显著异质性和相关的分子分类系统。这些成果对 WM 的诊断、预后评估和治疗具有重要的指导意义，有望推动 WM 研究和临床实践的进一步发展，为改善 WM 患者的治疗效果和预后提供新的思路和方法。