肝星状细胞分化的轨迹分析揭示了细胞承诺和纤维化的代谢调节

在这里，作者研究了人类多能干细胞向肝星状细胞（dihsc）分化的蛋白质组轨迹，并确定RORA是控制代谢重编程的关键转录因子，对dihsc的承诺、身份和静态表型至关重要。

　　

肝星状细胞分化轨迹分析揭示细胞命运与纤维化的代谢调控机制

来自 Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer（IDIBAPS）等多个单位的研究人员合作完成的论文 “Trajectory analysis of hepatic stellate cell differentiation reveals metabolic regulation of cell commitment and fibrosis” 发表于Nature Communications期刊。该研究通过探究肝星状细胞（HSCs）分化轨迹，揭示了关键转录因子 RORA 在调控细胞代谢、影响细胞命运和纤维化进程中的重要作用，为开发抗纤维化治疗策略提供了新的靶点和理论依据，对理解细胞分化和疾病发生机制具有重要意义。

研究背景

在胚胎发育过程中，细胞经历转录组和代谢重编程，发育信号通路在成年组织的维持和修复中可被重新激活。因此，研究细胞身份和命运的调控机制，对明确细胞分化路径至关重要。人类诱导多能干细胞（iPSCs）能分化为任何细胞类型，可用于模拟疾病状态，研究细胞生理和病理轨迹。

纤维化是多种慢性损伤疾病的共同特征，在工业化国家，近 45% 的死亡与纤维化相关，肝脏是受影响的主要器官之一。肝纤维化是大多数肝脏疾病的常见并发症，与死亡率和肝脏相关发病率密切相关。肝星状细胞（HSCs）是导致肝纤维化的主要细胞类型，在肝脏稳态时处于静止状态，损伤时被激活，转变为肌成纤维细胞样表型，参与伤口愈合和组织再生。在慢性肝损伤中，HSCs 持续激活，成为主要的纤维化细胞。细胞代谢对 HSCs 的激活至关重要，激活过程中 HSCs 会增加糖酵解、谷氨酰胺分解和从头脂肪生成。HSCs 静止表型的维持受转录因子严格调控，了解 HSCs 在发育和疾病中的轨迹，有助于识别预防 HSCs 激活或促进其恢复静止表型的分子途径，从而减轻慢性肝病中的纤维化。

RORA（维甲酸相关孤儿受体 α）是类固醇 / 甲状腺激素受体超家族的转录因子，在多种组织中表达，已知其在肝脏中调节肝细胞脂质、胆固醇和葡萄糖代谢，在细胞发育和分化中起重要作用，但在 HSCs 生理学中的作用尚不清楚。近期研究提示 RORA 可能参与 HSCs 的激活过程。

研究材料和方法

实验材料

• 细胞系：使用人 KULi003-A iPSC 系进行蛋白质组表征和体外实验；iCas9-FL-BCL 用于诱导系统；HepG2 细胞系购自 Sigma。

• 动物模型：使用 staggerer 小鼠（sg/sg）、RORA floxed（fl/fl）与 Lrat-Cre 杂交产生的 HSC 特异性 Rora 敲除小鼠、野生型（WT）C57BL/6 J 小鼠进行体内实验。

• 人类样本：使用巴塞罗那医院诊所肝脏科收治的肝病患者的肝活检组织或转移性肿瘤肝切除术的对照组织。

实验方法

• iPSCs 向 diHSCs 分化：参照先前描述的方案诱导 iPSCs 分化为 diHSCs，在分化的不同阶段添加特定细胞因子和化合物。

• 基因编辑：利用 CRISPR-Cas9 技术构建杂合 RORA 敲除 iPSCs 克隆；将 sgRNA 整合到慢病毒载体中，建立诱导型 RORA 敲除系统。

• 化学调控：在分化第 2 天添加 RORA 的合成激动剂（SR1078）或拮抗剂（SR1001），并在细胞传代后进行处理。

• 体外纤维化实验：对 diHSCs 进行传代，并用 TGFβ 处理，部分样本同时添加 SR1078。

• 共培养 3D 实验：将 diHSCs 和 HepG2 以 1:2 的比例构建肝脏球状体，进行相关处理和检测。

• 体外研究：分离大鼠新生儿心肌细胞（NCMs）和心脏成纤维细胞（NCFs），进行相应处理和分析。

• 样本处理与检测：对不同样本进行蛋白质组分析、RNA 提取、cDNA 合成、qRT-PCR 分析、Bulk RNA 测序、脂质组学分析、细胞内葡萄糖水平检测、细胞外通量检测、免疫荧光和免疫组化分析等。

技术路线

首先获取 iPSCs 分化为 diHSCs 过程中 7 个不同时间点的样本，进行基于质谱的蛋白质组分析，构建分化过程的蛋白质组路线图。通过主成分分析（PCA）和皮尔逊相关分析，确定分化阶段并筛选关键转录因子。利用基因编辑技术和化学调控方法，研究 RORA 在 diHSCs 分化、激活和代谢中的作用。在体内实验中，使用多种小鼠模型评估 RORA 对肝纤维化及其他器官纤维化的影响。最后，分析人类样本中 RORA 的表达与肝纤维化的相关性。

研究结果

diHSCs 与人类原代 HSCs 蛋白质组相似

通过对 iPSCs 分化为 diHSCs 过程的时间分辨蛋白质组分析，共鉴定出 3064 种蛋白质，其中 2475 种被定量。分化过程中，HSC 标记物增加，多能性蛋白减少。基因本体（GO）富集分析显示，第 0 天蛋白质主要富集在细胞增殖、翻译等相关通路，第 12 天则富集在细胞外基质（ECM）组织、胶原蛋白代谢等通路。基因集富集分析（GSEA）表明，diHSCs 蛋白质组特征与人类原代 HSCs 蛋白质组高度相似。

比较 diHSCs 和原代健康 HSCs（pHSCs）的蛋白质组，发现二者超过 60% 的蛋白质组谱重叠。pHSCs 中与激活表型相关的蛋白质富集，而 diHSCs 显示出更高的增殖状态。二者还共享与 ECM 重塑相关的蛋白质。此外，diHSCs 在分化过程中逐渐获得静止、激活以及 HSC 身份表型相关的通路表达。

蛋白质组驱动的细胞轨迹分析确定 RORA 是 diHSCs 分化的潜在驱动因子

PCA 显示样本在分化过程中呈现时间依赖性分布，皮尔逊相关分析将分化过程分为三个阶段：阶段 1（第 0 - 2 天），多能性和增殖相关蛋白质表达；阶段 2（第 4 - 6 天），代谢相关蛋白质、间充质和胎儿肝脏间皮蛋白质以及胎儿 HSC 标记物开始表达；阶段 3（第 8 - 12 天），成熟 HSCs 蛋白质和基质相关蛋白质富集。

比较不同阶段蛋白质组，发现阶段 1 到阶段 2 差异表达的蛋白质与间充质和间皮细胞特征相关，阶段 2 到阶段 3 差异表达的蛋白质与胶原蛋白和 ECM 组织相关。分析调节阶段转换的转录因子，确定 RORA 是调节阶段 1 到阶段 2 转换的最显著转录因子，MEIS1 调节阶段 2 到阶段 3 的转换。与 diHSCs 相比，RORA 在静止和激活的 pHSCs 中均上调，提示其在 HSCs 表型获得中的潜在作用。

RORA 促进 diHSCs 成熟表型，改善中胚层定向分化

从分化第 2 天到第 12 天用 RORA 激动剂 SR1078 处理细胞，虽未改变 diHSCs 形态，但增加了成熟 HSC 标记物的表达。GSEA 分析显示，RORA 激动作用促进静止基因特征表达，同时保留细胞对 TGFβ 的反应性。PCA 和功能转录组分析表明，RORA 激动作用诱导转录组变化，促进中胚层和间充质发育相关生物学过程，减少细胞增殖相关过程。

利用 CRISPR-Cas9 技术构建 RORA 杂合敲除 iPSCs 克隆，在分化过程中，这些细胞在第 4 天后近 80% 死亡。用 SR1078 处理可降低死亡率，使细胞完成分化，但与野生型相比，部分 HSC 标记物表达存在差异，且 RORA 敲除的 diHSCs 在塑料表面培养时激活程度更高。建立诱导型 RORA 敲除系统，在分化第 8 天诱导 RORA 敲除，结果显示分化细胞获得更激活的表型，化学拮抗剂 SR1001 处理野生型 iPSCs 也得到类似结果，表明 RORA 是中胚层和间充质分化的潜在转录调节因子，对 diHSCs 静止表型的获得至关重要。

RORA 促进 diHSCs 静止表型，防止其激活

在两种体外 diHSCs 激活模型中评估 RORA 的作用。用 SR1078 处理野生型 iPSCs 来源的传代 diHSCs，可抑制其激活，降低激活标记物 ACTA2 和 COL1A1 表达，增加静止标记物 LHX2 和 LRAT 表达。转录组分析显示，处理后细胞的从头脂肪生成和线粒体脂肪酸 β - 氧化相关 GO 减少，代谢通路发生改变。在 TGFβ 刺激的激活模型中，SR1078 同样能减少 diHSCs 的激活。在 3D 肝脏球状体模型中，SR1078 处理也降低了激活标记物的表达。这些结果表明，RORA 在维持 diHSCs 静止表型、防止其激活中发挥作用，可能通过阻断 HSCs 激活所需的代谢适应来实现。

RORA 在中胚层分化和 diHSCs 激活过程中调节细胞代谢

利用 Seahorse 实时细胞代谢分析仪检测发现，iPSC - RORA+/- 细胞在分化第 4 天（中胚层定向分化阶段）线粒体呼吸增加，糖酵解产生的 ATP 也增加，细胞内葡萄糖水平升高，表明其保留了未分化细胞的代谢特征。用 RORA 激动剂处理后，细胞内葡萄糖和糖酵解依赖的 ATP 产生减少，糖酵解基因表达降低，证实 RORA+/- 细胞在分化过程中无法启动向中胚层的分化，而 RORA 激动剂可纠正这一缺陷。

在 diHSCs 激活模型中，SR1078 处理降低了线粒体呼吸、OXPHOS 和糖酵解依赖的 ATP 产生，以及细胞内葡萄糖水平，同时减少了激活时增加的糖酵解和脂质合成相关基因的表达。脂质组学分析显示，SR1078 处理使传代 diHSCs 的脂质组向静止样表型转变，减少了高碳数和高饱和度的脂质。这些结果表明，RORA 在 diHSCs 分化和激活过程中作为代谢调节剂，影响细胞表型。

RORA 在体内调节纤维化

利用 staggerer 小鼠（RORA 缺陷型）研究 RORA 在 HSCs 激活和肝纤维化中的作用。在基础状态下，sg/sg 小鼠和 WT 小鼠肝脏纤维化程度无显著差异，但 sg/sg 小鼠肝脏中 Acta2 和 Timp1 激活标记物表达略有增加。用 CCl4 诱导肝纤维化 4 周后，sg/sg 小鼠肝脏纤维化程度增加，αSMA 染色增强，肝损伤标志物升高，纤维化相关基因表达显著增加。

给予 RORA 激动剂 SR1078 处理 CCl4 诱导的肝纤维化小鼠，可增加 Rora 基因表达，减轻肝脏损伤和纤维化，降低纤维化和 HSCs 激活标记物的基因表达。构建 HSC 特异性 Rora 敲除小鼠模型，发现敲除 Rora 后肝脏胶原蛋白沉积增加，αSMA 蛋白表达升高，进一步证实 RORA 在体内纤维化过程中的作用。

在多器官纤维化模型中，SR1078 处理可减轻心脏和肾脏的纤维化。在心脏纤维化模型中，SR1078 促进 Rora 表达，降低心脏纤维化基因表达，减少 ECM 沉积；在肾脏纤维化模型中，SR1078 降低肾脏羟脯氨酸含量，虽未显著降低 αSMA 表达，但减少了纤维化相关基因表达。这些结果表明，激活 RORA 是减轻多器官纤维化的有前景的策略。

RORA 基因表达与人类肝纤维化呈负相关

评估 RORA 在肝硬化患者中的表达，发现与对照组相比，肝硬化患者肝组织中 RORA 蛋白和基因表达均降低。HSCs 从肝硬化患者中分离后，RORA 表达低于静止 HSCs。在不同阶段慢性肝病患者队列中，RORA 基因表达随 Metavir F1 - 4 阶段逐渐降低，与 FIB4 纤维化评分呈负相关，且与 HSC 激活和纤维化标记物的表达呈负相关。

研究结论

本研究通过对 iPSCs 向 diHSCs 分化过程的时间分辨蛋白质组分析，构建了分化的蛋白质组路线图，确定了 RORA 是调节 diHSCs 分化、维持静止表型和防止激活的关键转录因子。RORA 在中胚层和间充质分化中起重要作用，影响细胞代谢，调节脂质代谢和能量产生途径。体内实验证实 RORA 在肝纤维化及多器官纤维化中起关键调控作用，其激动剂可减轻纤维化。临床研究表明，RORA 表达与人类肝纤维化程度呈负相关。

研究讨论

本研究利用 iPSCs 分化模型，揭示了 HSCs 分化轨迹和关键分子驱动因素，为理解 HSCs 在健康和疾病状态下的生物学特性提供了重要依据。研究发现 RORA 在细胞分化和纤维化中的关键作用，为开发抗纤维化治疗策略提供了新靶点。然而，由于缺乏高质量抗体和有效捕获方法，未能进行 RORA 的 ChIP - Seq 分析，限制了对其调控机制的深入理解。

纤维化是多种器官对慢性损伤的共同反应，本研究表明 diHSCs 可作为其他组织中周细胞的模型，RORA 调节多器官周细胞激活，有望成为抗纤维化治疗的潜在靶点。代谢重编程在胚胎发育和细胞应激反应中至关重要，RORA 通过调节代谢影响 diHSCs 的分化和激活，提示代谢灵活性在 diHSCs 分化轨迹中的重要性。本研究强调了研究细胞分化和疾病过程中细胞轨迹的重要性，为进一步研究细胞命运调控和开发新型治疗策略奠定了基础。