一种针对人类PCSK9的有效表观遗传编辑器，可持久降低低密度脂蛋白胆固醇水平

在肝脏中对PCSK9进行表观遗传编辑，旨在诱导DNA甲基化和沉默基因表达，在表达人类PCSK9基因的转基因小鼠和食蟹猴中实现了LDL胆固醇水平的长期降低。

　　

靶向人类 PCSK9 的强效表观遗传编辑器：降低低密度脂蛋白胆固醇水平的新突破

近日，来自 Chroma Medicine 的 Frederic Tremblay 等人在《Nature Medicine》杂志上发表了题为 “A potent epigenetic editor targeting human PCSK9 for durable reduction of low - density lipoprotein cholesterol levels” 的研究论文。这一研究在心血管疾病治疗领域具有重要意义，为降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL - C）水平提供了一种全新的、潜在更有效的治疗策略，有望打破现有治疗范式，改善患者的长期心血管健康。

一、研究背景

心血管疾病是全球范围内的主要死因，而高胆固醇血症，尤其是高水平的低密度脂蛋白胆固醇（LDL - C），是引发心血管疾病的关键危险因素。降低 LDL - C 水平一直是心血管疾病预防和治疗的重要目标。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶 /kexin 9 型（PCSK9）在调节 LDL - C 水平中起着关键作用，它可以与低密度脂蛋白受体（LDLR）结合，促进 LDLR 的降解，从而减少肝脏对血液中 LDL - C 的清除。因此，抑制 PCSK9 的功能成为降低 LDL - C 水平的重要策略。

传统的基因编辑方法，如 CRISPR - Cas9 核酸酶编辑，通过产生双链 DNA 断裂来实现基因编辑，但这种方式可能会导致染色体异常等潜在的基因毒性风险。碱基编辑和引导编辑虽然能够进行单核苷酸改变或靶向插入新的 DNA 序列，但也存在潜在的基因毒性，且在体内逆转这些 DNA 序列变化的能力尚未见报道。相比之下，表观遗传编辑无需改变 DNA 序列，通过调节基因的甲基化状态来实现基因表达的调控，具有潜在的安全性优势。诱导启动子区域的 CpG 二核苷酸位点发生 DNA 甲基化，可以有效地将基因锁定在沉默状态，并且这种修饰可以在细胞分裂过程中稳定遗传。基于此，开发一种靶向 PCSK9 的表观遗传编辑器，通过调节 PCSK9 基因的甲基化状态来降低 LDL - C 水平，具有重要的研究价值和临床应用前景。

二、研究材料和方法

（一）细胞培养和转染

研究使用了 HeLa 细胞、来自嵌合人源化肝脏小鼠（PXB 细胞）的原代人肝细胞（PHHs）以及原代食蟹猴肝细胞（PCHs）。HeLa 细胞在含有 10% 胎牛血清、1× 青霉素 - 链霉素和 1×GlutaMAX 的 DMEM 培养基中培养。细胞转染分为 DNA 转染和 RNA 转染，DNA 转染时使用 Mirus TransIT - LT1 试剂，RNA 转染时使用 Mirus TransIT - mRNA 试剂，并通过 CellTiter - Glo 检测细胞活力，用 LEGEND MAX Human PCSK9 ELISA 试剂盒检测细胞上清液中的 PCSK9 蛋白水平。

（二）RNA 生产

100 - mer gRNAs 由商业供应商化学合成，在体外筛选实验中，gRNAs 的 5' 和 3' 末端的三个核苷酸进行了 2'-O - 甲基化和硫代磷酸酯键修饰，后续实验使用的 gRNAs 还包含广泛的内部 2'-O - 甲基化。mRNA 通过体外转录和纯化获得，以含有表观遗传编辑器（EE）或对照构建体的质粒为模板，使用 T7 RNA 聚合酶、NTPs（包括 N1 - 甲基假尿苷）和帽类似物进行转录，mRNA 或进行酶促 A - 加尾，或在模板中编码 polyA。

（三）LNP 配方

用于初始 PHH 实验的 EE mRNA 和 gRNA 的小规模 LNP 配方使用预制备的脂质混合物 GenVoy - ILM 试剂盒在 NanoAssemblr Spark 上制备。小鼠和非人灵长类动物（NHP）规模的 LNP 配方按照先前描述的方法制备，旨在获得大小均匀、封装效率高的 LNP。LNP 由可电离的阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和 PEG - 脂质组成，最终得到的 LNP 直径约为 80nm，封装效率超过 90%。

（四）动物研究

在人 PCSK9 转基因小鼠（PCSK9 - Tg）实验中，根据基线血浆 PCSK9 蛋白水平将 8 - 16 周龄的雄性和雌性小鼠随机分为不同实验组，通过静脉注射给予载体对照或各种含有遗传或表观遗传编辑器的 LNP 药物产品。在部分肝切除术（PHx）实验中，PCSK9 - Tg 小鼠先用 PCSK9 - EE 进行表观遗传沉默 8 周，然后进行三分之二肝切除术或假手术。在 PCSK9 重新激活实验中，PCSK9 - Tg 小鼠先进行表观遗传沉默，然后给予含有 dCas - Tet 的 LNP。实验过程中定期收集动物血浆，使用 Simple Plex Human PCSK9 检测试剂盒分析循环 PCSK9 蛋白水平，在安乐死或手术时收集肝脏活检组织进行 DNA 或 RNA 分析。

在食蟹猴实验中，选择 2 - 4 岁的雄性猴子，对 PCSK9 基因座进行基因分型，确保 gRNAs 结合位点的 DNA 序列无突变。根据体重和社会单元将猴子随机分为不同实验组，在输注前 1 天和 30 - 60 分钟给予预处理药物（苯海拉明、地塞米松和法莫替丁），通过静脉输注给予 LNP 配方或生理盐水载体。实验中收集外周静脉血，获取血清和血浆样本进行临床化学和食蟹猴 PCSK9 生物标志物分析，在研究期间通过超声引导的经皮活检收集肝脏活检组织。

（五）测序分析

包括 RNA 测序（RNA - seq）、Twist Human Methylome 杂交捕获测序、靶向杂交捕获甲基化测序（定制面板）、靶向扩增子亚硫酸氢盐测序和全基因组甲基化测序（WGMS），用于分析基因表达变化、DNA 甲基化状态等，具体数据分析使用相应的软件和工具进行。

三、研究结果

（一）强效 PCSK9 靶向 EE 的鉴定

研究人员设计了一种由 DNMT3A、DNMT3L 和 KRAB 转录抑制结构域与催化失活的酿脓链球菌 Cas9（dCas9）融合的单一 EE 构建体。通过在 HeLa 细胞中进行 gRNA 筛选，发现多个 gRNAs 能显著降低 PCSK9 水平，其中最有效的 gRNAs 靠近转录起始位点（TSS）。在原代人肝细胞（PHHs）中，选择活性和持久性最佳的 gRNAs 进行测试，结果表明，用含有 EE mRNA 和这些 gRNAs 的脂质纳米颗粒（LNPs）处理 PHHs，能快速且持续抑制 PCSK9 分泌至少 14 天。在表达人 PCSK9 基因的小鼠（PCSK9 - Tg）中，筛选出的单 gRNA（gRNA41）和 gRNA 对（gRNA41 + gRNA49）在单次给予 LNP 后，能显著降低循环 PCSK9 水平，且双 gRNA 组合（gRNA41 + gRNA49）在实现 PCSK9 基因座的表观遗传沉默方面更有效。

（二）PCSK9 靶向 EE 的特异性

在 PHHs 中评估 PCSK9 - EE 的潜在脱靶表观遗传编辑，通过 RNA - seq 测量基因表达变化和通过杂交捕获测量 DNA 甲基化变化。结果显示，PCSK9 - EE 处理后，PCSK9 蛋白和转录水平显著降低，表明靶向活性有效。除了低表达且在肝细胞中甲基化无变化的 ENSG00000285976 基因外，没有其他基因因 PCSK9 - EE 处理而发生显著变化。虽然在潜在脱靶位点检测到 CpG 甲基化的小幅度增加，但这些变化并未导致基因表达的显著改变。进一步的全基因组甲基化测序（WGMS）也证实了 PCSK9 - EE 的特异性，即甲基化变化主要集中在 PCSK9 基因座，且对附近基因的表达没有功能性影响。

（三）PCSK9 靶向 EE 在小鼠中的作用

给 PCSK9 - Tg 小鼠单次注射含有 PCSK9 - EE 的 LNPs（3mg/kg）后，循环 PCSK9 水平几乎完全降低（>98%），且这种抑制效果可持续至少 1 年，与野生型 Cas9 核酸酶的效果相似。同时，肝脏 PCSK9 表达显著降低，血浆胆固醇水平也随之降低。通过部分肝切除术（PHx）小鼠模型研究发现，PCSK9 - EE 诱导的 PCSK9 沉默在肝脏再生过程中能够完全维持，表明表观遗传编辑在稳态和再生肝脏中均具有持久性，且能通过细胞分裂保持。

（四）PCSK9 靶向 EE 效应的可逆性

设计并测试了一种由 TET1 催化结构域与 dCas9 融合的表观遗传激活剂 dCas - Tet。在先前用 PCSK9 - EE 沉默 PCSK9 的小鼠中，给予含有 dCas - Tet 和 gRNA41 + gRNA49 的 LNP 后，血浆 PCSK9 水平在 2 周内几乎完全恢复正常（~90% 的基线水平），并维持 8 周。靶向甲基化分析显示，用表观遗传激活剂处理的小鼠肝脏中 PCSK9 基因座的 CpG 甲基化总体降低。

（五）PCSK9 靶向 EE 在猴子中的作用

设计优化版本的 PCSK9 - EE（PCSK9 - EE - V2）在食蟹猴原代肝细胞（PCHs）和体内进行测试。在 PCHs 中，PCSK9 - EE - V2 能完全抑制 PCSK9 分泌，但效力比在 PHHs 中低约三倍。在食蟹猴体内的剂量反应研究中，单次输注含有 PCSK9 - EE - V2 的 LNP 后，循环 PCSK9 水平迅速降低并维持至少 3 个月，LDL - C 水平也相应降低，在 1mg/kg 剂量下达到最大药理反应。肝脏活检显示，PCSK9 - EE - V2 处理导致 PCSK9 基因座的多个 CpG 甲基化增加，且与血浆 PCSK9 水平强烈相关。虽然在 0.5mg/kg 组中有一只猴子 PCSK9 基因座的甲基化较低，血浆 PCSK9 和 LDL - C 变化较小，但总体上 PCSK9 - EE - V2 在食蟹猴体内显示出良好的活性和潜力。

四、研究结论与讨论

本研究成功开发了一种靶向人 PCSK9 的表观遗传编辑器（EE），该编辑器通过诱导 PCSK9 基因座的 CpG 甲基化，能在小鼠和非人灵长类动物（NHPs）中有效、持久地降低循环 PCSK9 蛋白水平，进而显著降低 LDL - C 水平。与传统基因编辑方法相比，这种表观遗传编辑技术无需产生单链或双链 DNA 断裂，避免了潜在的基因毒性风险。同时，通过使用与 Tet 酶融合的相同靶向剂，实现了对 PCSK9 基因座表观遗传编辑的可逆性。

在临床应用方面，当前治疗高胆固醇血症的方法，如 PCSK9 单克隆抗体和小干扰 RNA（siRNA），需要长期给药，而本研究中的 PCSK9 靶向 EE 有望发展为单剂量治疗方案，为高胆固醇血症患者提供更便捷、有效的治疗选择，特别是对于那些难以坚持长期治疗的患者，这可能意味着终身心血管风险的降低。然而，在进入临床测试之前，还需要进一步评估 PCSK9 靶向 EE 的疗效、耐受性和安全性，包括更多的体内研究以评估药物产品的药效学、药代动力学特性、生物分布和潜在的毒理学效应。

总体而言，这项研究展示了表观遗传编辑在体内调节基因表达的巨大潜力，为心血管疾病的治疗开辟了新的途径，为未来开发基于表观遗传编辑的创新疗法奠定了坚实基础。