利用深度定量糖谱分析（DQGlyco）揭示蛋白质糖基化动力学和异质性

在这里，作者提出了深度定量糖谱分析（DQGlyco），一种能够高通量分析蛋白质糖基化动力学的方法。使用DQGlyco，他们将肠道微生物组组成与脑糖蛋白联系起来，并提供对糖型功能和组织特异性的见解。

　　

深度定量糖蛋白组分析技术（DQGlyco）：揭示蛋白质糖基化的奥秘

欧洲分子生物学实验室基因组生物学部门的研究人员克莱门特?M?波特尔（Clément M. Potel）等人在《Nature Structural & Molecular Biology》杂志上发表了题为 “Uncovering protein glycosylation dynamics and heterogeneity using deep quantitative glycoprofiling (DQGlyco)” 的论文。该研究开发了深度定量糖蛋白组分析技术（DQGlyco），为蛋白质糖基化研究提供了强大的工具，有助于深入理解蛋白质糖基化在正常生理过程和疾病发生发展中的作用机制，对揭示生命过程的奥秘以及开发新的疾病诊断和治疗方法具有重要意义。

一、研究背景

蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，在细胞信号传导、细胞黏附、细胞间相互作用等关键生物学过程中发挥着重要作用。大约三分之一的人类蛋白质会经历分泌途径，其中绝大多数在进入高尔基体进一步修饰之前，会在内质网中进行 N - 糖基化修饰。超过 200 种不同的糖基化酶可以依次作用，产生具有不同组成和结构的聚糖，这不仅导致了糖基化的宏观异质性（不同位点的糖基化），还产生了微观异质性（同一位点连接的不同聚糖种类）。蛋白质糖基化的异常与多种疾病相关，如癌症和神经元疾病等。然而，目前对蛋白质糖基化的理解仍存在诸多障碍，其中缺乏高度选择性的糖蛋白组富集策略以及高通量定量方法来精确测量糖基化是主要限制因素。尽管已开发出多种从蛋白质消化物中富集糖肽的方法，但这些方法存在技术局限性，如对某些类型聚糖组成或结构存在偏向性、富集特异性较低等问题。

二、研究材料与方法

（一）细胞培养

使用经验证无污染的 HeLa Kyoto 细胞和 HEK293T 细胞，在含有特定成分的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO?条件下培养，细胞生长至一定密度后收集、冻存备用。

（二）小鼠实验

选用无菌 C57BL/6 小鼠，在无菌隔离器中饲养，通过 PCR 和培养法监测无菌状态。实验小鼠接受人类粪便样本定植或实验室菌株定植，定植后饲养 14 天，采集脑、肝、肾等组织样本并冻存。

（三）样本制备

样本（细胞系或组织）采用特定裂解缓冲液裂解，通过核酸沉淀、蛋白沉淀、酶解、脱盐等步骤处理样本，随后进行糖肽富集，部分样本进行 TMT 标记用于定量分析。

（四）实验处理

开展 2FF 时间进程实验，用 2 - 氟岩藻糖（2FF）处理 Expi293F 细胞，在不同时间点收集细胞；通过 PNGase 或蛋白酶 K 处理完整的活 HEK293 细胞，测定表面暴露的糖型；对小鼠脑组织进行溶解度蛋白质组分析和热蛋白质组分析。

（五）数据分析

使用 MSFragger 等软件进行数据库搜索，对糖肽进行鉴定和定量；将糖肽分类为不同的聚糖类别；运用多种 R 包进行通路和结构域富集分析、比较糖基化谱、分析与数据库信息的相关性等。

三、关键技术路线

（一）DQGlyco 工作流程

开发的 DQGlyco 工作流程利用商业化的苯硼酸（PBA）功能化硅胶珠选择性富集完整糖肽。样本制备过程中优化裂解缓冲液，去除 RNA 干扰，调整质谱扫描范围提高糖肽识别率。整个流程在 96 孔板中进行，实现高通量样本处理。

（二）增加糖蛋白组覆盖度

在小鼠脑样本分析中，采用多孔石墨化碳（PGC）作为第一维色谱分离，结合 C18 反相分离，提高对糖基化微观异质性的捕获能力。

（三）定量分析策略

通过 TMT 标记结合富集后标记策略，降低试剂使用量，实现多达 18 种条件的多重定量，且具有高定量重现性。

四、研究结果

（一）蛋白质糖基化的灵敏特异性富集

优化样本制备和质谱扫描范围后，使用 PBA 功能化硅胶珠可高效富集糖肽。在人细胞系和小鼠脑样本中分别鉴定出大量独特的糖肽、糖基化位点和糖蛋白，富集选择性超过 90%，且提高了糖蛋白组的覆盖度。

（二）小鼠脑糖蛋白组的深度分析

利用 PGC 分离，在小鼠脑样本中鉴定出 177,198 个独特的 N - 糖肽和 8,245 个 N - 糖基化位点，位于 3,741 个 N - 糖蛋白上，相比以往研究有显著提升。同时还鉴定出大量 O - 糖肽和 O - 糖蛋白，并对其特征进行了分析。

（三）DQGlyco 揭示广泛的微观异质性

尽管部分糖基化位点仅被一两种糖型修饰，但许多位点表现出高微观异质性，平均每个位点有 17.4 种糖型。不同细胞系和小鼠脑的 N - 糖基化类别分布存在差异，且不同 N - 糖基化类别在特定功能蛋白结构域上显著富集。通过机器学习模型发现，高微观异质性位点倾向于位于更有序的结构区域，且细胞外糖基化位点的微观异质性程度高于细胞内。

（四）糖型的深度多重定量

开发的成本效益高的 TMT 标记定量方法，可实现高通量定量分析，且重现性高。

（五）岩藻糖基化抑制揭示糖型特异性动力学

用 2FF 处理 HEK293f 细胞后，发现岩藻糖基化逐渐下降，且不同糖型的调节存在差异，呈现出位点特异性和糖型特异性的调节模式。

（六）细胞表面暴露糖型的测定

通过对活细胞进行 PNGase 或蛋白酶 K 处理，发现高甘露糖糖型一般较少暴露于细胞表面，而岩藻糖基化或唾液酸化糖型至少部分暴露于细胞表面，且两种酶处理结果具有良好相关性。

（七）糖基化组织特异性的表征

对小鼠脑、肝、肾组织的糖蛋白组进行定量分析，发现整体糖蛋白组具有组织特异性，且组织特异性源于部分相关性较差的糖基化位点。高组织特异性的糖基化位点在细胞黏附、信号传导和免疫相关的结构域中显著富集。

（八）生物物理糖蛋白组学

通过溶解度蛋白质组分析，发现高甘露糖糖型比成熟糖型更易溶解，且同一蛋白上不同糖型的溶解度存在差异，表明糖基化微观异质性对体内蛋白质状态有广泛影响。

（九）肠道微生物群调节小鼠脑糖蛋白组

不同肠道微生物群定植的小鼠，其脑蛋白质组和糖蛋白组发生显著变化。蛋白质丰度变化主要集中在线粒体蛋白和 G 蛋白 γ - 亚基上，糖型水平变化主要发生在轴突导向和神经传递相关蛋白上，且存在广泛的位点特异性调节。

五、研究结论

研究人员开发的 DQGlyco 技术整合了高通量样本制备、高灵敏度检测和精确的多重定量，能够以前所未有的深度研究蛋白质糖基化动力学和异质性。通过该技术，在小鼠组织和人类细胞系中对蛋白质糖基化进行了深度分析，揭示了糖基化的广泛微观异质性、组织特异性以及肠道微生物群对脑糖蛋白组的影响。此外，还开发了评估糖型溶解度的新策略，为理解糖型的生物物理性质提供了新视角。

六、研究讨论

本研究在蛋白质糖基化研究方面取得了重要进展，但仍存在一些有待进一步研究的问题。研究表明，改善 MS 采集方法和 PGC 分级分离可提升所有糖蛋白组富集平台的性能，而核酸沉淀主要有利于 PBA 富集前的样品制备。AlphaFold 预测有助于确定位点特异性结构特征，但蛋白质结构对糖基化的影响仍需深入研究。本研究的定量分析方法为识别疾病特异性糖基化模式提供了可能，对跨组织的糖基化分析有助于理解异常糖基化与疾病的关系，有望用于生物标志物的鉴定。此外，研究发现肠道微生物群可调节脑糖蛋白组，这为研究肠道微生物群与大脑生理学之间的联系提供了新的证据，但具体的分子机制仍需进一步探索。本研究为解决蛋白质糖基化领域的诸多未决问题提供了框架，为未来研究糖基化变化的动力学以及糖基化微观异质性对蛋白质功能的影响奠定了基础，对推动功能糖蛋白组学的发展具有重要意义。