由Mnl1/Htm1甘露糖苷酶和蛋白二硫异构酶的双功能复合体启动ERAD

作者阐明了甘露糖苷酶Mnl1和蛋白二硫异构酶（Pdi1）的复合物如何启动内质网相关蛋白降解（ERAD）。Mnl1使错误折叠的烯丙基化，球状蛋白和Pdi1然后减少二硫化物，产生能适应ERAD的未折叠蛋白。

　　

探秘内质网相关蛋白降解起始机制：Mnl1/Htm1 甘露糖苷酶与蛋白二硫键异构酶双功能复合物的关键作用

在细胞的生命活动中，蛋白质的质量控制至关重要。内质网作为蛋白质合成与折叠的关键场所，其中错误折叠的糖蛋白若不及时清除，会对细胞功能产生严重影响。哈佛医学院霍华德?休斯医学研究所和西湖大学生命科学与生物医药实验室的研究人员 Dan Zhao、Xudong Wu 和 Tom A. Rapoport 在《Nature Structural & Molecular Biology》杂志上发表了题为 “Initiation of ERAD by the bifunctional complex of Mnl1/Htm1 mannosidase and protein disulfide isomerase” 的论文。该研究成果为深入理解内质网相关蛋白降解（ERAD）的起始机制提供了关键线索，在细胞生物学领域具有重要意义。

研究背景

内质网中错误折叠的糖蛋白会通过 ERAD 途径被转运到细胞质并由蛋白酶体降解，以维持细胞内环境的稳定。在酿酒酵母中，ERAD-L 途径对于错误折叠的 N - 糖基化蛋白的降解机制研究较为深入。这些蛋白的聚糖首先会被葡糖苷酶和甘露糖苷酶 Mns1 修剪生成 Man8 糖型，随后甘露糖苷酶 Mnl1（也称为 Htm1）将其进一步加工为含有暴露 α1,6 - 甘露糖残基的 Man7 糖型，这一修饰使错误折叠的糖蛋白被 Hrd1 复合物识别，进而被泛素化并降解 。然而，Mnl1 催化的这一关键步骤的具体机制尚不明确，且 Mnl1 与蛋白二硫键异构酶（Pdi1）形成稳定复合物的原因也不清楚。Pdi1 通常参与新合成蛋白质中半胱氨酸的氧化形成二硫键，同时它还具有多种功能，但其在 ERAD 中的确切作用尚未确定。

研究材料和方法

研究材料

研究选用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株 INVSc1、BY4741、BY4743、mnl1Δ、gsh1Δ、ubc7Δ 和 pep4Δ 等，以及哺乳动物细胞 FreeStyle 293 - F。实验中使用了多种质粒，用于表达目的蛋白及突变体，如编码 Mnl1 - Pdi1 复合物、CPY*、Mns1、Ero1 等蛋白的质粒 。此外，还用到了一系列抗体，包括抗 FLAG 抗体、抗 HA 抗体、抗 PGK1 抗体、抗 PDI 抗体、抗 MBP 抗体等，用于蛋白的检测与分析。

研究方法

1. 蛋白纯化：从酿酒酵母细胞中纯化 Mnl1 - Pdi1 复合物及其他相关蛋白，利用不同的亲和树脂和色谱柱进行分离和纯化；从 FreeStyle 293 - F 细胞中纯化 His 标签蛋白时，采用了类似的亲和纯化及柱层析方法 。

2. 冷冻电镜（cryo - EM）技术：制备 Mnl1 - Pdi1 复合物的冷冻电镜样品，在 Titan Krios EM 仪器上收集数据，通过 MotionCor2、CTFFIND4、crYOLO、RELION 3.0 等软件进行图像处理和模型构建，以解析复合物的结构 。

3. 酶活性检测：采用改进的甘露糖苷酶活性检测方法，通过与特定底物孵育，结合荧光标记和 SDS - PAGE 分析，检测 Mnl1 - Pdi1 复合物的甘露糖苷酶活性；通过监测 RNAse 活性，检测 Pdi1 在复合物中的氧化还原功能 。

4. 细胞实验：运用 CHX chase 实验检测蛋白的降解情况；通过共免疫沉淀（Co - IP）实验分析蛋白之间的相互作用；利用 pull - down 实验检测复合物与底物的结合能力；通过动态光散射实验检测蛋白的聚集情况 。

技术路线

研究人员首先从过表达 Mnl1 - FLAG 和 Pdi1 的酿酒酵母细胞中纯化 Mnl1 - Pdi1 复合物，利用冷冻电镜技术解析其结构。接着，通过一系列生化和细胞实验，包括酶活性检测、突变体分析、蛋白 - 蛋白相互作用研究等，探究复合物的功能机制。利用不同折叠状态的底物，如 RNase B 的多种变体，研究复合物对底物的识别和作用特异性。通过在细胞中进行相关实验，验证复合物在体内的功能，如对 CPY* - HA 降解的影响，以及对底物二硫键的还原作用 。

研究结果

Mnl1 - Pdi1 复合物的结构

通过冷冻电镜技术，研究人员获得了 Mnl1 - Pdi1 复合物的结构，其整体分辨率达到 3.0 ?。Mnl1 由典型的甘露糖苷酶结构域（MHD）、与 Pdi1 相互作用的环以及 C 末端结构域（CTD）组成。MHD 形成一个带有中央孔的桶状结构，容纳糖蛋白底物的聚糖；CTD 与甘露糖苷酶桶的一侧弱相互作用。Pdi1 含有四个硫氧还蛋白样（Trx）域，其与 Mnl1 的相互作用界面较大。此外，Mnl1 的环中的两个半胱氨酸与 Pdi1 的 Trx 域 a 和 a’中的氧化还原活性 CGHC 基序的第一个半胱氨酸形成可逆的二硫键，但该二硫键并非两蛋白相互作用所必需 。

Pdi1 维持 Mnl1 在 ER 腔中的可溶性

Mnl1 与 Pdi1 的相互作用界面上的突变会影响 Mnl1 在 ERAD - L 中的功能。破坏 Mnl1 环与 Pdi1 的 b’Trx 域或 a 域相互作用的突变体，导致 Mnl1 在去污剂溶解的膜组分中的水平降低，形成不溶性聚集体，表明 Pdi1 主要负责维持 Mnl1 在 ER 腔中的可溶性，且可能参与 Mnl1 在 ER 中的定位 。

Mnl1 - Pdi1 复合物中 CTD 识别错误折叠的球状蛋白

缺失 CTD 的 Mnl1（Mnl1ΔC）对 CPY * 的甘露糖苷酶活性显著降低，且在 ERAD 中无活性。CTD 具有一个明显的疏水凹槽，将凹槽中的三个疏水残基突变为亲水氨基酸的突变体（mCTD）在 ERAD 中也存在缺陷，且纯化的 Mnl1（mCTD） - Pdi1 复合物的甘露糖苷酶活性降低。通过对不同折叠状态的 RNase B（RB）进行实验发现，Mnl1 - Pdi1 复合物优先识别和处理部分折叠的球状蛋白，而非折叠的 RB 或完全展开的 RBun 。

Pdi1 修饰 CTD 的底物特异性

单独纯化的 CTD（MBP - CTD）优先结合完全展开的多肽，而在 Mnl1 - Pdi1 复合物中，Pdi1 似乎使 CTD 忽略展开的多肽。RBun 会导致 Mnl1 - Pdi1 复合物解离，且 RBun 优先结合 Pdi1 而非 Mnl1。通过 pull - down 实验和显微镜观察实验进一步证实，球状错误折叠蛋白 RBΔS 和 RBsc 结合到 Mnl1 的 CTD，而完全展开的蛋白 RBun 结合到 Pdi1 。

Mnl1 修饰 Pdi1 的氧化还原反应

在 Mnl1 - Pdi1 复合物中，Pdi1 不再能执行其经典的氧化功能，即与 Ero1 合作形成二硫键，这是由于 Mnl1 阻止了 Ero1 与 Pdi1 的结合。然而，Pdi1 在复合物中仍可作为二硫键还原酶发挥作用。当 Mnl1 - Pdi1 复合物与荧光标记的 RBΔS 在 GSH 存在下孵育时，二硫键被还原为游离巯基。此外，Mnl1 - Pdi1 复合物的异构酶活性不受影响，且在体内实验中，该复合物能够还原 ERAD 底物 CPY* - HA 的二硫键 。

Mnl1 - Pdi1 在体内还原 ERAD 底物的二硫键

在缺乏谷胱甘肽合成酶 Gsh1 的酿酒酵母细胞中，CPY* - HA 的降解受到抑制，添加 GSH 或过表达 Mnl1 - Pdi1 复合物可恢复其降解。通过对 CPY* - HA 进行 2 - kDa PEGmal 修饰实验直接监测发现，Mnl1 - Pdi1 复合物在 ERAD 过程中可还原 CPY* - HA 的二硫键 。

研究结论与讨论

研究结论

本研究揭示了 Mnl1 - Pdi1 复合物通过对糖蛋白底物进行两个关键反应，即修剪聚糖和还原二硫键，启动 ERAD - L。Mnl1 的 CTD 识别球状错误折叠蛋白，产生暴露的 α1,6 - 甘露糖残基作为降解信号；随后，复合物中的 Pdi1 利用 GSH 还原去甘露糖化蛋白的二硫键，生成可跨内质网膜逆向转运的未折叠多肽 。

研究讨论

在细胞内，N - 糖基化蛋白在 ER 腔中经历初始聚糖加工和二硫键形成过程，错误折叠的蛋白通常呈球状结构。Mnl1 - Pdi1 复合物优先作用于这类错误折叠的球状蛋白，确保只有终末错误折叠的蛋白被降解，而折叠中间体不被误降解。复合物中的两个组分相互影响，Pdi1 改变 Mnl1 的 CTD 底物特异性并维持其可溶性，Mnl1 则使 Pdi1 成为 ERAD 中关键的二硫键还原酶 。

虽然在体外实验中，单独的 Pdi1 可作为净还原酶，但在体内，其与 Mnl1 形成复合物可能更高效地发挥作用。Mnl1 - Pdi1 复合物的功能在真核生物中可能具有保守性，尽管不同物种中 Mnl1 的同源物结构存在差异，但它们都可能与 PDI - 样酶相互作用，参与 ERAD 过程。未来的研究可进一步探索不同物种中该复合物的功能差异，以及其在疾病发生发展中的潜在作用 。

综上所述，该研究深入解析了 Mnl1 - Pdi1 复合物在 ERAD 起始过程中的作用机制，为理解细胞内蛋白质质量控制提供了重要的理论基础，有望为相关疾病的治疗和药物研发提供新的靶点和思路。