CD8+ T细胞与肿瘤细胞的空间接近预测乳腺癌新辅助治疗的疗效

　　

免疫细胞空间分布与乳腺癌新辅助治疗疗效的关联研究解读

广州医科大学附属肿瘤医院的 Hongling Liang 等研究人员在npj Breast Cancer期刊上发表了题为 “Spatial proximity of CD8+ T cells to tumor cells predicts neoadjuvant therapy efficacy in breast cancer” 的论文。该研究对乳腺癌新辅助治疗（NAT）具有重要意义，其揭示了免疫细胞空间分布与治疗效果之间的关系，为乳腺癌个性化治疗策略的制定和靶向免疫疗法的发展提供了关键依据。

一、研究背景

乳腺癌严重威胁女性健康，尽管诊疗技术不断进步，但仍是重大医疗挑战。新辅助治疗在乳腺癌治疗中占据重要地位，它在手术前进行，目的是缩小肿瘤体积、清除微转移病灶，其疗效常用病理完全缓解（pCR）衡量。然而，pCR 受多种因素影响，包括肿瘤雌激素受体（ER）/ 人表皮生长因子受体 2（HER2）状态、分子亚型和基因标记等。

近年来，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的存在和空间分布成为治疗结果的关键预测指标。免疫细胞在肿瘤区域呈现不同的分散模式，在肿瘤间质和上皮内区域的定位不同，其密度和位置影响治疗效果，尤其是在免疫检查点抑制剂治疗中。在众多免疫细胞中，CD8+ T 细胞是重要的抗癌细胞毒性物质，其存在与临床结果改善相关，在三阴性乳腺癌（TNBC）中，免疫细胞浸润情况对预后影响显著。不过，免疫细胞空间分布，特别是 CD8+ T 细胞，作为乳腺癌 NAT 疗效预测指标的临床意义，尚未结合其他免疫细胞成分在多种乳腺癌亚型中全面研究，免疫细胞与癌细胞之间的功能相互作用和接近程度指标也未得到充分探究。

二、研究材料与方法

（一）患者队列与肿瘤标本

研究选取 2014 年 1 月至 2018 年 11 月在广州医科大学附属肿瘤医院接受新辅助治疗的 104 例非转移性乳腺癌患者。纳入标准为 IIB 至 IIIC 期、20 - 80 岁女性、接受 NAT 且同意进行生物标志物检测；排除转移性乳腺癌和未接受 NAT 的早期乳腺癌患者。该研究获医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。收集患者治疗前后的组织样本，制成福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，同时收集患者的临床数据。

（二）临床分子分型与病理评估

依据美国临床肿瘤学会（ASCO）/ 美国病理学家协会（CAP）指南，通过免疫组织化学（IHC）结果确定分子亚型，对 HER2 + 且 IHC 评分 2 + 的肿瘤进一步用荧光原位杂交（FISH）评估，以 20% 为界区分 Ki-67 表达高低。依据美国癌症联合委员会指南进行 ypTN 分期，规定 pCR 为乳腺和腋窝淋巴结无残留浸润癌，主要病理反应（MPR）为切除组织中残留肿瘤组织≤10%，依据 RECIST 1.1 标准评估客观缓解率（ORR）。

（三）组织病理分析

对手术标本进行处理制成 FFPE 切片，进行苏木精 - 伊红（H&E）染色，选择癌细胞含量最高的切片进行 CD3 染色和多重免疫组化。严格定义肿瘤内 T 细胞或免疫细胞为与癌细胞直接接触且无间质细胞间隔的细胞。

（四）多重免疫荧光染色

运用 PANO 7 - plex IHC 试剂盒处理 104 对治疗前后的肿瘤样本，可在同一切片同时观察六种标记物。经抗原修复、封闭、孵育一抗、二抗和 TSA 荧光团等步骤染色，用 DAPI 复染后封片。用 PerkinElmer Mantra System 扫描切片，借助 inForm 软件建立光谱库获取重建图像，进行 AI 辅助分析，计算各类免疫细胞浸润百分比。

（五）免疫细胞指标选择

由于组织样本大小和细胞性存在差异，采用免疫细胞百分比（特定免疫细胞占总核细胞的比例）而非绝对细胞密度，该指标与绝对密度相关性强，可实现样本间标准化比较。

（六）空间距离计算与分析

跟踪患者临床数据和生存情况至 2021 年 10 月 1 日，中位随访 69.2 个月。用 InForm 软件提取细胞信号强度数据，设定阈值确定免疫标记阳性，计算肿瘤细胞与免疫细胞间的欧氏距离，生成距离矩阵，最终得出每个视野内平均靠近肿瘤细胞的免疫细胞数（within_Mean）。

（七）统计分析

使用 SPSS 22.0 软件进行统计分析，连续数据以均值 ± 标准差表示，用 X - tile 软件确定免疫生物标志物最佳临界值，用 Kaplan - Meier 法计算生存差异，log - rank 检验差异显著性，用 Cox 比例风险模型进行单因素和多因素分析评估事件发生时间，用 GraphPad Prism 9 软件绘图，用 Wilcoxon 检验比较治疗前后免疫细胞丰度差异，用 Mann - Whitney 检验和 Kruskal - Wallis 检验分析独立样本，用 Spearman 相关分析确定变量间相关性，P < 0.05 为差异有统计学意义，未进行多重检验校正。

三、研究结果

（一）患者特征与临床结果

104 例患者纳入研究，涵盖多种肿瘤亚型。患者接受不同 NAT 方案，中位无病生存期（DFS）为 54.2 个月，中位总生存期（OS）为 61.8 个月。

（二）免疫细胞分布在乳腺癌预后中的作用

通过多重免疫荧光分析多种免疫细胞与肿瘤细胞的空间关系，经逻辑回归和 Cox 回归分析发现，总 CD8+ T 细胞、间质 CD8+ T 细胞、肿瘤内 CD8*PD1+ T 细胞等多种免疫细胞百分比是 pCR 的重要预测指标；总 CD8+ T 细胞、总 FoxP3 细胞和分期是 DFS 和 OS 的重要预测指标。Kaplan - Meier 生存分析显示，高浸润的 CD8+ T 细胞（总 CD8+ T 细胞和间质 CD8+ T 细胞）和低水平的 FoxP3 细胞与更长的 DFS 和 OS 相关；间质中 PD - L1 + 和 PD - L1+PANCK + 细胞水平升高与 DFS 负相关，CD68+PD - L1 + 细胞与 DFS 和 OS 正相关。

（三）CD8 T 细胞 proximity 在乳腺癌 NAT 预后中的关键作用

AI 辅助分析显示，CD8 T 细胞在 20μm 距离内与 pCR、DFS 和 OS 显著相关，该范围内 CD8+ T 细胞比例越高，临床结果越好；CD4 T 细胞在该范围内与 pCR 有一定关联，但与 DFS 和 OS 无显著关联；CD68 细胞和 FoxP3 细胞在该范围内与临床终点无显著关联。治疗后，pCR 患者 20μm 范围内 CD8+ T 细胞密度显著下降，所有患者组 20μm 范围内 CD4、CD68 和 FoxP3 免疫细胞百分比下降，未达到 pCR 的患者部分免疫细胞治疗后增加。

（四）免疫细胞分布在乳腺癌亚型中的差异

四种肿瘤亚型的 OS 和 DFS 无显著差异。TNBC 患者免疫细胞浸润，尤其是 T 细胞浸润，高于其他亚型；HER - 2 阳性和 TNBC 亚型中 FoxP3 调节性 T 细胞更普遍；TNBC 中 CD68+LAG3 + 和 CD68+PD - L1 + 细胞显著增加。

（五）CXCL9 和 CXCR3 与 N20 - CD8+T 及上皮内 CD3+T 细胞的相关性

对 39 例患者肿瘤样本进行单重免疫组化，发现 CXCL9 和 CXCR3 表达与 T 细胞在肿瘤微环境中的接近程度和浸润显著正相关，二者自身表达水平也显著正相关，但它们对 DFS 和 OS 无显著预后价值。

四、研究结论

该研究全面分析了乳腺癌 NAT 患者免疫细胞的空间分布，发现肿瘤细胞 20μm 范围内 CD8+ T 细胞（N20 - CD8+ T 细胞）的接近程度与 pCR、DFS 和 OS 显著相关，可作为 NAT 疗效的可靠预测生物标志物，且在不同乳腺癌亚型和 NAT 方案中均有此关联。研究还揭示了 CXCL9 和 CXCR3 在招募 T 细胞进入肿瘤核心中的重要作用，它们与 T 细胞定位相关，虽无独立预后价值，但对肿瘤免疫初始阶段有贡献。此外，研究观察到不同乳腺癌亚型免疫细胞群体存在差异，TNBC 患者免疫细胞浸润较高。同时，研究发现 NAT 后免疫细胞发生动态变化，监测 CD8+ T 细胞接近程度的变化有助于评估 NAT 疗效和肿瘤免疫微环境。

五、研究讨论

此前研究虽表明肿瘤微环境中的免疫细胞与乳腺癌临床结果相关，但免疫效应细胞与肿瘤核心内恶性细胞的详细空间动态，尤其是接近程度，研究尚不充分。本研究假设肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），特别是 CD8 T 细胞与癌细胞的接近程度，可作为乳腺癌 NAT 疗效的预测生物标志物，并通过实验进行了验证。

该研究的优势在于确定了与 CD8 T 细胞接近程度相关的潜在预测生物标志物，为趋化因子研究提供新方向，全面分析肿瘤微环境为后续研究奠定基础。不过，研究也存在局限性，如回顾性设计和单中心研究影响结果的多样性和普遍性；样本量，尤其是 TNBC 样本量较小，影响该亚组研究结果的可靠性；免疫细胞密度和接近程度指标的最佳临界值未在独立队列中验证，可能存在队列特异性；使用 CD68 作为巨噬细胞通用标记，无法区分 M1 和 M2 亚型。

总体而言，该研究强调了免疫细胞与癌细胞 20μm 接近程度作为预测乳腺癌 NAT 疗效生物标志物的重要性，明确了肿瘤微环境中关键免疫细胞与临床表型和治疗结果的关系，趋化因子在引导 T 细胞浸润中的作用为潜在治疗靶点。肿瘤微环境的个体差异凸显了个性化治疗的重要性，随着对肿瘤微环境中免疫细胞平衡和相互作用的深入了解，未来需要更全面的治疗策略。人工智能和机器学习技术有望进一步推动对肿瘤微环境的理解，发现更多生物标志物和治疗机会，未来还需深入研究肿瘤微环境中细胞的复杂作用和相互关系，以优化乳腺癌治疗。