时空转录组学揭示了暴发性病毒性心肌炎的发病机制

　　

时空转录组学揭示暴发性病毒性心肌炎发病机制研究解读

华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科的研究人员 Huihui Li、Xueting Chen 等，在期刊Signal Transduction and Targeted Therapy上发表了题为 “Spatiotemporal transcriptomics elucidates the pathogenesis of fulminant viral myocarditis” 的论文。该研究通过整合单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）和空间增强分辨率组学测序（Stereo-seq）技术，全面解析了柯萨奇病毒 B3（CVB3）诱导的暴发性心肌炎（FM）的发病机制，为该疾病的治疗提供了关键靶点和新策略，对改善 FM 患者预后具有重要意义。

一、研究背景

心肌炎多由病毒感染引发，如 CVB3、细小病毒 B19 等，近年来，抗肿瘤药物和 COVID - 19 的流行使心肌炎发病率和死亡率上升。暴发性心肌炎（FM）是心肌炎的最严重形式，起病急骤、进展迅速，常导致心脏功能障碍、恶性心律失常甚至猝死。FM 的发病机制涉及病毒直接损伤和免疫介导损伤，但具体免疫机制尚不明确，这给疾病的诊断和治疗带来挑战。

此前的单细胞研究虽揭示了心脏浸润免疫细胞的部分特征，但缺乏空间信息和疾病进程多时间点分析。空间转录组学（ST）能提供基因表达的空间图谱，与单细胞转录组学结合，可更全面理解免疫发病机制，为 FM 研究带来新契机。

二、研究材料与方法

（一）实验动物

选用 6 周龄雄性 A/J 小鼠，分为 FM 模型组（腹腔注射 噬斑形成单位的 CVB3）、对照组（注射等量磷酸盐缓冲液）、IVIG 治疗组（FM 模型基础上，每日腹腔注射 1mg/kg IVIG）以及其他药物处理组（如 SPI1 抑制剂、干扰素 γ 抗体处理组等）。记录小鼠生存情况、体重变化，实验结束时进行心脏功能检测并取材。

（二）实验技术与分析方法

1. 组织学分析：对心脏组织进行石蜡包埋、切片，进行免疫组化、免疫荧光和苏木精 - 伊红染色（H&E），检测病毒感染及组织病理变化。

2. 测序技术：构建单细胞核 mRNA 文库和空间转录组文库，分别用 Illumina NovaSeq 6000 和 MGI DNBSEQ - T1 平台测序。对原始数据进行处理，包括比对、过滤、UMI 计数等，得到基因表达矩阵。

3. 数据分析方法：运用多种 R 包和 Python 工具进行数据处理与分析，如 Seurat 包用于细胞聚类、差异基因分析；CellChat 分析细胞间通信；Mfuzz 识别基因动态表达模式；Cell2location 整合单细胞和空间转录组数据等。

三、研究技术路线

研究人员先构建 FM 小鼠模型，在感染后 1 - 7 天不同时间点采集心脏样本。对样本进行 snRNA - seq 和 Stereo - seq，获取单细胞和空间转录组数据。然后对数据进行处理和分析，包括细胞聚类、基因表达模式分析、细胞间通信分析等。通过这些分析，研究人员探究病毒在心脏细胞中的感染情况、免疫细胞和心脏结构细胞的变化，以及细胞间相互作用对疾病进程的影响。最后，通过体内外实验验证关键分子机制，并评估 IVIG 等药物的治疗效果。

四、研究结果

（一）CVB3 感染心脏的单细胞核和空间转录组测序

对健康和感染 CVB3 的 A/J 小鼠心脏进行 snRNA - seq 和 Stereo - seq 分析。snRNA - seq 鉴定出 14 种主要细胞类型，随着疾病进展，心肌细胞比例减少，免疫细胞比例增加，趋化因子和分泌因子表达上升。Stereo - seq 分析显示，炎症区域随时间扩大，感染反应评分升高。整合两种技术，确定巨噬细胞、T 细胞等为炎症区域主要细胞群体，成功构建 FM 小鼠时空转录景观。

（二）心肌炎组织中空间受限的基因表达模式

基于 Stereo - seq 数据，研究人员识别出 9 个基因模块。模块 2 与横纹肌收缩功能相关，其表达下降暗示心肌细胞收缩功能丧失；模块 3 在疾病进展中更普遍，与炎症相关途径富集；模块 8 在感染 1 天（dpi）时，在抗病毒和对干扰素 α（IFN - α）反应途径中显著富集。snRNA - seq 数据计算的基因分数也证实炎症、凋亡分数上升，心肌收缩分数下降，IFN - α 分数在 1 dpi 达到峰值，且中性粒细胞在早期对疾病反应中起重要作用。

对不同空间区域分析发现，心室区域与 PI3K 和 TRAIL 途径相关，心肌炎症区域炎症反应相关途径激活，且疾病后期正常心肌细胞也出现炎症激活和缺氧途径变化。

（三）间皮细胞触发宿主先天免疫反应

通过 Pearson 相关性分析划分疾病早期（1 - 3 dpi）和晚期（4 - 7 dpi）。早期病毒反应相关途径富集，间皮细胞 CVB3 阳性比例和感染反应评分最高，是 CVB3 在心脏的主要靶细胞。感染后，间皮细胞通过释放损伤相关分子模式激活巨噬细胞，并参与集落刺激因子（CSF）信号通路，支持巨噬细胞生长。

（四）巨噬细胞表现出强烈的促炎活性并募集细胞毒性 T 细胞

在疾病晚期，炎症区域周围的边界区富含成纤维细胞，细胞外基质（ECM）评分升高。从心室区域到边界区再到炎症区域，炎症反应增强。研究人员鉴定出不同阶段的巨噬细胞和 T 细胞亚群，外周血单核细胞经激活分化为 Inflammatory_Mac，其具有高促炎和趋化活性，通过释放趋化因子和上调 MHC 分子激活效应 T 细胞，导致组织损伤。

（五）效应 T 细胞释放的 IFN - γ 通过 Spi1 诱导心肌细胞死亡

随着疾病进展，心肌细胞损伤加剧，死亡基因表达增加。效应 T 细胞具有高细胞毒性，释放 IFN - γ，空间共定位分析表明其与心肌细胞损伤相关。在 FM 患者和小鼠模型中，SPI1 是调节心肌细胞死亡的关键转录因子，IFN - γ 可诱导 Spi1 表达，沉默 Spi1 能减轻 IFN - γ 介导的心肌细胞死亡，Spi1 抑制剂治疗 FM 小鼠可降低死亡率、改善心脏功能。

（六）静脉注射免疫球蛋白（IVIG）治疗减轻 FM 炎症

IVIG 治疗 FM 小鼠可降低死亡率、减少炎症评分和病毒 RNA 水平，减少炎症区域面积和免疫细胞浸润，尤其是促炎巨噬细胞。这降低了巨噬细胞与效应 T 细胞的通信，减少效应 T 细胞数量和细胞毒性分子释放，降低心肌细胞中 Spi1 活性，减少心肌细胞死亡，展现出强大的免疫调节作用和治疗潜力。

五、研究结论与讨论

本研究利用 ST - seq 和 snRNA - seq 技术，深入剖析了 CVB3 诱导的 FM 发病机制。研究发现间皮细胞是疾病起始的主要感染细胞，激活巨噬细胞引发炎症反应；巨噬细胞和效应 T 细胞在疾病进展中发挥关键作用，效应 T 细胞释放的 IFN - γ 通过 Spi1 诱导心肌细胞死亡；IVIG 治疗能有效减轻炎症、保护心脏功能，其机制是抑制 IFN - γ/Spi1 轴。

尽管该研究取得重要进展，但仍存在局限性。研究仅聚焦心脏，未涉及其他可能受影响的器官；单一动物模型可能限制结论的普遍性；部分细胞亚群和细胞间相互作用结论需进一步验证。未来研究可采用谱系追踪等技术深入探究免疫细胞发育，利用人体样本研究炎症微环境对心脏损伤的影响，推动研究成果向临床应用转化。

总体而言，该研究为 FM 的病理机制提供了全面深入的理解，所确定的分子标记和治疗靶点为开发新型治疗策略奠定了坚实基础，有望改善 FM 患者的预后，在心血管疾病研究领域具有重要的理论和实践意义。