Src抑制增强急性髓系白血病中MCL-1拮抗剂的活性

　　

Src 抑制增强 MCL - 1 拮抗剂在急性髓系白血病中的活性研究解读

弗吉尼亚联邦大学（Virginia Commonwealth University）的 Xiaoyan Hu 等研究人员在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上发表了题为 “Src inhibition potentiates MCL - 1 antagonist activity in acute myeloid leukemia” 的论文。该研究揭示了 Src 抑制剂与 MCL - 1 拮抗剂联合治疗急性髓系白血病（AML）的协同作用及机制，为 AML 的治疗提供了新策略，对改善 AML 患者预后具有重要意义。

一、研究背景

AML 是一种常见的成人白血病，尽管有针对特定基因异常的新型药物和骨髓移植治疗手段，但多数患者仍无法治愈，尤其是复发 / 难治性疾病患者，因此急需更有效的治疗方法。

在 AML 的发生发展过程中，促凋亡和抗凋亡调节蛋白的失衡起着关键作用。MCL - 1 作为一种重要的抗凋亡蛋白，在 AML 中频繁上调，对白血病干细胞的存活至关重要，已成为多种恶性肿瘤的治疗靶点。基于此，研究人员开发了 MCL - 1 拮抗剂，如 S63845、MIK665 等，部分已进入临床试验阶段。然而，MCL - 1 拮抗剂在 AML 治疗中的效果受到限制，主要原因是通过泛素蛋白酶体系统导致的补偿性 MCL - 1 积累，从而减弱了其促凋亡活性。

Src 家族激酶（SFKs）与白血病的发生相关，其激活与预后不良有关。酪氨酸激酶抑制剂如达沙替尼和博舒替尼具有 SFK 抑制作用，在 AML 模型中显示出临床前活性，并已被批准用于慢性髓系白血病（CML）的治疗。已有研究表明，Src 抑制可降低 MCL - 1 的丰度，且 MCL - 1 抑制剂会诱导 MCL - 1 上调作为补偿反应。因此，本研究旨在验证使用 Src 抑制剂逆转 MCL - 1 拮抗剂诱导的 AML 细胞中 MCL - 1 积累这一假设，并明确其增强抗 AML 活性的机制。

二、研究材料与方法

（一）细胞系与试剂

研究使用了多种细胞系，包括人白血病细胞系 U937、MV4 - 11、MOLM - 13、OCI - AML3 以及人成年心室心肌细胞系 AC16 等。试剂方面，使用了 MCL - 1 拮抗剂（S63845、MIK665）、Src 抑制剂（博舒替尼 SKI - 606、达沙替尼）等，所有药物均溶解于 DMSO 并储存于 - 80°C，实验中 DMSO 终浓度不超过 0.1% 。

（二）细胞培养与处理

细胞系按照各自的标准方法进行培养，实验使用对数生长期的细胞。将细胞暴露于不同浓度的药物中，处理特定时间后，进行后续检测分析。

（三）动物模型

建立了多种动物模型，包括 U937 细胞侧翼肿瘤模型、荧光素酶标记的 MV4 - 11 细胞侧翼模型、全身荧光素酶标记的 MV4 - 11 模型以及 AML 患者来源的异种移植（PDX）模型。在动物实验中，严格遵循相关动物实验伦理和操作规范，对动物进行分组、给药处理，并监测肿瘤生长、体重变化等指标。

（四）检测方法

运用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析相关蛋白的表达水平和磷酸化状态；通过流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期等；利用实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）测定基因转录水平；采用免疫沉淀技术研究蛋白质之间的相互作用；借助代谢组学分析细胞代谢变化；运用磷酸化阵列分析蛋白磷酸化状态；使用统计学方法（如 Student t 检验、方差分析、中位剂量效应分析等）评估实验数据的显著性。

三、研究结果

（一）MCL - 1 与 Src 抑制剂在 AML 细胞中的相互作用

研究人员将 U937 细胞分别暴露于 MCL - 1 拮抗剂 S63845（20 nM）或 SKI - 606（2 μM）单独处理时，细胞活力影响较小，但联合处理显著增加了细胞死亡，表现为 PARP 和 caspase - 3 裂解以及 γH2A.X 形成。Annexin V 染色显示细胞凋亡明显增加，中位剂量效应分析表明这种联合作用具有协同性。同样的结果在 MCL - 1 拮抗剂 MIK665 与 SKI - 606 联合处理时也得到验证，且在多个 AML 细胞系（如 MV4 - 11、MOLM - 13 和 OCI - AML3）中均观察到类似的协同相互作用。此外，达沙替尼与 S63845 或 MIK665 联合处理也能协同增加细胞死亡，表明 Src 抑制剂可协同增强 MCL - 1 抑制剂的抗白血病活性。

（二）MCL - 1 和 Src 在 AML 细胞中作用的基因验证

为证实 MCL - 1 抑制剂的靶向效应，构建了表达 MCL - 1 shRNA 的 U937 细胞系，这些细胞 MCL - 1 表达降低，对 SKI - 606 更为敏感，PARP 和 caspase - 3 裂解以及 γH2A.X 生成增加。同时，利用 shRNA 敲低 Src 的 U937 细胞对 S63845 诱导的细胞死亡也更为敏感。在 MV4 - 11 细胞中也得到了类似结果，这些发现证实了 Src 和 MCL - 1 拮抗剂在促进 AML 细胞死亡中的靶向作用。

（三）MCL - 1 下调在联合治疗介导的细胞死亡中的功能作用

Western blot 分析显示，S63845 会使 AML 细胞中 MCL - 1 表达急剧增加，但 SKI - 606 联合给药可阻断这一现象，MIK665 与 SKI - 606 联合处理时也有相同效果。过表达 MCL - 1 的细胞对 S63845/SKI - 606 或 MIK665/SKI - 606 介导的细胞死亡具有抗性，表明防止 MCL - 1 拮抗剂介导的 MCL - 1 上调在 Src 拮抗剂增强 MCL - 1 抑制剂诱导的白血病细胞死亡中发挥重要作用。

（四）联合 MCL - 1 抑制剂 / SKI - 606 介导的细胞死亡需要 BAK 和 BAX

免疫沉淀分析表明，U937 细胞联合暴露于 S63845 和 SKI - 606 后，胞质细胞色素 C 增加，胞质 BAX 和 BAK 减少，BAX 和 BAK 构象变化 / 激活增加，且 MCL - 1 与 BAK 的结合减少，BAX 与 BAK 的共沉淀增加。BAK 和 BAX CRISPR 敲除细胞中，S63845/SKI - 606 介导的细胞死亡显著减少，在双敲除细胞中几乎完全消失。在 MV4 - 11 细胞中也观察到类似结果，表明 Src/MCL - 1 抑制剂介导的细胞死亡严重依赖于 BAX 和 BAK 的激活。

（五）MCL - 1 抑制剂 / SKI - 606 方案以 STAT3 依赖的方式诱导细胞凋亡

鉴于 SFKs 与 STAT3 激活以及 STAT3 对 MCL - 1 转录的调控关系，研究人员假设 Src 抑制剂对 MCL - 1 拮抗剂抗白血病作用的影响可能涉及 STAT3。Western blot 结果显示，S63845 和 SKI - 606 联合处理 U937 细胞，增强了 STAT3 在 Ser727 和 Tyr705 激活位点的去磷酸化，阻断了 MCL - 1 上调，并下调了 STAT3 靶基因 c - MYC 和 BCL - xL 的表达。ImageStream 分析和 qRT - PCR 验证了这些结果，且过表达持续激活的 STAT3 可部分抵抗 SKI - 606/S63845 介导的细胞活力降低和细胞凋亡。在 MIK665 与 SKI - 606 联合处理以及 MV4 - 11 细胞中也得到类似结果，表明 Src 抑制剂介导的 STAT3 失活及其导致的细胞保护靶点下调在 Src/MCL - 1 拮抗剂诱导的白血病细胞死亡中起重要作用。

（六）c - MYC 和 BCL - xL 下调在 MCL - 1/SFK 抑制剂致死作用中的功能意义

过表达 c - MYC 或 BCL - xL 的 U937 细胞对 SKI - 606/S63845 和 SKI - 606/MIK665 方案的敏感性显著降低，表明 Src 破坏抑制 STAT3 激活并减少 MCL - 1、c - MYC 和 BCL - xL 表达的能力，在增强抗白血病活性中具有重要功能。

（七）MCL - 1/SFK 抑制剂方案促进 MCL - 1 的 NOXA 和泛素化相关降解

研究发现，蛋白酶体抑制剂 MG - 132 可阻止 S63845 和 SKI - 606 联合处理导致的 MCL - 1 下调，表明蛋白酶体降解参与其中。联合处理还增加了 MCL - 1 的 K48 泛素化降解，同时显著提高了 NOXA 的表达。敲低 NOXA 的细胞对 S63845/SKI - 606 介导的细胞活力丧失更具抗性，MCL - 1 下调减少，MCL - 1 的 K48 泛素化降解也显著降低。在 U937 细胞与 MIK665 联合处理以及 MV4 - 11 细胞中也观察到类似现象，说明 Src 抑制通过多种机制阻断 MCL - 1 上调并促进白血病细胞死亡。

（八）MCL - 1/SFK 抑制在体外显著诱导原发性 AML 原始细胞凋亡，但对正常 CD34 细胞无影响

对原发性 AML 原始细胞的研究表明，S63845 + SKI - 606 或 MIK665 + SKI - 606 联合处理可显著增加凋亡细胞数量，中位剂量效应分析显示具有协同作用，且在更原始的细胞群体中也得到验证。而正常 CD34 细胞暴露于联合处理中未增加细胞死亡，正常人类成年心室心肌细胞系 AC16 在联合处理后细胞死亡也未增加。Western blot 分析显示，联合处理可诱导原发性 AML 原始细胞中 STAT3 Tyr705 去磷酸化、MCL - 1 下调和 caspase - 3 裂解。

（九）MCL - 1 抑制剂 / SKI - 606 方案在小鼠异种移植模型中的体内抗白血病疗效

在多种小鼠异种移植模型中，包括 U937 细胞侧翼肿瘤模型、荧光素酶标记的 MV4 - 11 细胞侧翼模型、全身荧光素酶标记的 MV4 - 11 模型以及 AML 患者来源的异种移植（PDX）模型，S63845/SKI - 606 联合治疗显著降低了肿瘤体积、肿瘤负担，延长了动物生存时间，且未引起体重减轻或其他明显毒性。在 PDX 模型中，联合治疗显著减少了外周血、骨髓和脾脏中的白血病细胞数量。

（十）MCL - 1/Src 抑制剂协同作用的蛋白质组学分析

对 U937 细胞进行蛋白质组学分析，发现联合 S63/SKI 处理独特诱导了 45 种上调和 23 种下调的蛋白质。Reactome 通路富集分析显示，上调的蛋白质主要富集在 PINK1 - PRKN 介导的线粒体自噬和通用线粒体自噬途径；下调的蛋白质涉及多个信号通路，包括糖原合成和降解、AXIN 信号、APC 信号等，且部分下调蛋白质与 BCL2 信号有显著联系，提示这些蛋白质和相关通路的扰动可能有助于联合治疗的抗 AML 作用。

（十一）代谢组学分析揭示联合治疗对细胞代谢的影响

对细胞进行非靶向代谢组学分析，主成分分析（PCA）显示未处理、SKI、S63 和 S63 + SKI 处理的细胞之间存在明显分离。联合处理组的代谢物变化模式与单一药物处理组不同，协同作用表现为联合处理组中糖酵解中间产物（如果糖 1,6 - 二磷酸、甘油醛 - 3 - 磷酸和 3 - 磷酸甘油酸）的增加幅度大于单一药物处理组，且联合处理组在糖酵解 / 糖异生途径及其他代谢途径中均有显著变化，表明联合治疗诱导的代谢变化可能有助于两种药物的协同作用。

（十二）MCL - 1/Src 抑制剂协同作用的磷酸化阵列分析

磷酸化阵列分析显示，不同处理组之间底物磷酸化水平存在差异。联合 S63 + SKI 处理组中，VEGF 相关通路的激活尤为显著，同时激酶 LIMK1、MAPK9 和 CHEK1 的活性显著增加，而激酶 FER 和 MAPKAPK5 的活性显著降低，这些激酶和通路的变化可能有助于联合治疗的抗 AML 活性。

四、研究结论与讨论

本研究表明，Src 抑制剂（如博舒替尼、达沙替尼）可有效阻断 MCL - 1 拮抗剂介导的 MCL - 1 上调，与 MCL - 1 拮抗剂联合使用时，在体外和体内均能显著增强对 AML 细胞的抗白血病活性。其作用机制是多方面的：Src 抑制剂通过促进 MCL - 1 的降解性泛素化，阻止抗凋亡蛋白 MCL - 1 的稳定和积累；抑制 STAT3 转录因子的激活磷酸化，下调多个与 AML 细胞存活和增殖相关基因（如 MCL - 1、BCL - xL 和 c - MYC）的转录；联合处理导致 NOXA 显著上调，促进 MCL - 1 的降解。这些事件共同触发了 BAX/BAK 介导的细胞死亡的显著增强和协同的抗 AML 活性。

此外，蛋白质组学、代谢组学和磷酸化阵列分析表明，其他蛋白质和信号通路的扰动（如 PPP25RE 和 PP2CA 的下调、VEGF 相关通路的激活、糖酵解途径的变化等）也可能有助于联合治疗的抗白血病效果，但它们与上述主要机制的相对功能贡献仍有待确定。

值得注意的是，MCL - 1/Src 抑制剂方案对原发性 AML 细胞（包括更原始的祖细胞群体）具有毒性，但对正常造血祖细胞（如 CD34 + 细胞）相对安全，且在体外对人成年心室心肌细胞系无明显毒性。在多种 AML 异种移植和 PDX 模型中，该联合治疗方案耐受性良好，显著改善了治疗效果。

鉴于 TKI/Src 抑制剂已在临床获批，MCL - 1 拮抗剂也正在白血病和其他多种恶性肿瘤中进行评估，本研究提出的 Src/MCL - 1 联合治疗策略可能为 AML 及其他肿瘤疾病的治疗提供新的方向，具有重要的临床应用潜力，值得进一步深入研究和探索。