牛源犬新孢子虫不同抗原疫苗组合免疫实验动物的研究：为牛新孢子虫病防控带来新希望

为解决牛新孢子虫病（Neosporosis）缺乏有效防控手段的问题，研究人员开展牛源犬新孢子虫（Neospora caninum）不同抗原疫苗组合免疫的研究。制备 NcGRA9 重组亚单位疫苗和 Ad5-NcAMA1 重组腺病毒疫苗免疫小鼠和延边黄牛，结果显示联合免疫效果佳且对肝肾功能无影响，为牛新孢子虫病疫苗研发提供方向。

　　牛新孢子虫病是一种对畜牧业危害极大的原虫病，它由犬新孢子虫（Neosporosis caninum）引起。这种寄生虫主要感染怀孕动物，会导致流产、死胎和胎儿木乃伊化等严重后果，尤其是在牛群中，它已成为威胁养牛业健康发展的重要疾病之一。目前，针对牛新孢子虫病，既没有有效的疫苗，也缺乏特效药物。现有的疫苗，如活疫苗，存在成本高、储存期短、毒力返强以及病原体易扩散等问题；其他类型的疫苗，像一些灭活疫苗、DNA 疫苗等，虽然在免疫反应诱导方面有一定效果，但在预防胎儿感染等关键环节上仍不尽人意。在这样的背景下，开展新的疫苗研究迫在眉睫。

延边大学的研究人员为了探索更有效的牛新孢子虫病防控方法，开展了一项关于牛源犬新孢子虫不同抗原疫苗组合免疫的研究。他们制备了 NcGRA9 重组亚单位疫苗和 Ad5-NcAMA1 重组腺病毒疫苗，并分别对 C57BL/6 小鼠和延边黄牛进行免疫实验，相关研究成果发表在《Parasites & Vectors》上。

研究人员在开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。首先，从牛胎儿脑组织获取牛源犬新孢子虫，并在 Vero 细胞中进行培养与纯化。实验动物选用了从辽宁长生生物技术有限公司购买的 40 只 C57BL/6 小鼠，以及从安图肉牛养殖场获取的 20 只成年雌性延边黄牛。之后，通过基因克隆技术，获取 NcGRA9 基因并进行表达，制备出 NcGRA9 重组亚单位疫苗；同时，利用相关基因序列设计引物，制备出 Ad5-NcAMA1 重组腺病毒疫苗。实验过程中，采用 ELISA 技术检测免疫小鼠和黄牛血清中的免疫球蛋白亚类和细胞因子水平；运用荧光定量 PCR 技术检测小鼠各组织中的寄生虫负荷；使用全自动动物生化分析仪检测免疫后小鼠和黄牛的肝肾功能相关指标。

研究结果如下：

1. NcGRA9 基因的克隆与表达：以犬新孢子虫的 DNA 为模板，通过 PCR 扩增出 522-bp 的条带，成功构建重组质粒 pMD-18 T-NcGRA9 和 PGEX-4 T-NcGRA9。经 western blot 分析，NcGRA9 的分子量为 45.1 kDa，且纯化后的重组蛋白具有良好的反应性。
2. 免疫小鼠血清免疫球蛋白检测：ELISA 检测结果表明，免疫小鼠血清中 IgG、IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgA 和 IgE 水平随免疫次数增加显著上升。不同疫苗免疫组之间，在不同时间点各免疫球蛋白水平存在差异。联合免疫组（NcGRA9 + Ad5-NcAMA1）在免疫后期，血清中多种免疫球蛋白水平显著高于单一疫苗免疫组。
3. 免疫小鼠血清细胞因子检测：免疫小鼠血清中 IFN-γ、TNF-α 和 IL-4 水平经 ELISA 检测发现，Ad5-NcAMA1 组的 IFN-γ 水平在 7 - 28 天显著高于 NcGRA9 组；NcGRA9 组的 TNF-α 水平在 7 - 28 天显著高于 Ad5-NcAMA1 组。联合免疫组在 21 和 28 天，这三种细胞因子水平均显著高于单一疫苗免疫组。
4. 免疫后小鼠健康状况检测：对免疫后的小鼠进行 16 项健康指标检测，发现免疫小鼠的总胆红素和肌酐水平较低，肌酸激酶水平较高，但与正常对照组相比，差异均不显著，说明疫苗对小鼠肝肾功能无影响。
5. 免疫对感染犬新孢子虫小鼠存活率的影响：寄生虫攻毒实验结果显示，NcGRA9 组小鼠存活率为 70%，Ad5-NcAMA1 组为 75%，联合免疫组高达 85%，而对照组仅为 10%。
6. 免疫对感染犬新孢子虫小鼠主要器官寄生虫负荷的影响：荧光定量 PCR 检测发现，感染犬新孢子虫后，各免疫组小鼠主要器官中的寄生虫负荷显著低于对照组。联合免疫组小鼠脑和肝组织中的寄生虫负荷低于 NcGRA9 组和 Ad5-NcAMA1 组，且免疫组小鼠心脏和肺组织中未检测到犬新孢子虫。
7. 免疫黄牛血清免疫球蛋白检测：ELISA 检测免疫黄牛血清中的 IgG、IgG_2a、IgG_2b、IgA、IgM 和 IgE 发现，这些免疫球蛋白水平均随免疫次数显著增加。不同免疫组在不同时间点各免疫球蛋白水平有所不同，联合免疫组在免疫后期多种免疫球蛋白水平显著高于单一疫苗免疫组。
8. 免疫黄牛血清细胞因子水平检测：ELISA 检测免疫黄牛血清中 IL-4、IFN-γ 和 TNF-α 的表达，发现各免疫组这些细胞因子的表达均较免疫前显著增加。联合免疫组在 14 和 28 天，IL-4 表达显著高于单一疫苗免疫组；Ad5-NcAMA1 组在 7 天 IFN-γ 表达较高，14 天较低；联合免疫组在 21 - 28 天，TNF-α 表达显著高于其他三组。
9. 免疫后黄牛健康状况检测：对免疫后的黄牛进行相关检测，发现 Ad5-NcAMA1 组无异常，联合免疫组和 NcGRA9 组肌酸激酶略有升高，NcGRA9 组总蛋白略有升高，但与正常对照组相比均无显著差异，表明疫苗对黄牛肝肾功能无影响。

研究结论和讨论部分指出，犬新孢子虫病对畜牧业的影响日益严重，而 NcGRA9 此前研究较少。本研究成功克隆表达 NcGRA9 基因并制备疫苗，与 Ad5-NcAMA1 重组腺病毒疫苗单独或联合免疫小鼠和黄牛后，均诱导了较高水平的体液和细胞免疫反应，显著降低了小鼠脑和肝组织中的寄生虫负荷，且对小鼠和黄牛的肝肾功能无不良影响，联合疫苗效果最佳。这表明 NcGRA9 + Ad5-NcAMA1 有望成为牛新孢子虫病的候选疫苗，为牛新孢子虫病的防控提供了新的方向和希望，对推动畜牧业健康发展具有重要意义。