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为解决 LCA5 相关视网膜疾病机制不明及治疗手段有限的问题，研究人员开展 LCA5 基因敲除视网膜类器官的研究，发现 LCA5 缺失的特征及小分子治疗效果。该研究为理解疾病机制和开发新疗法提供重要依据，值得科研人员一读。
在眼科疾病的世界里，有一种极为棘手的病症 ——Leber 先天性黑蒙（Leber Congenital Amaurosis，LCA）。它就像一个隐藏在黑暗中的 “小恶魔”，专门盯上孩子们，是儿童中最严重的遗传性失明类型。这种病的发病率虽然不高，大约每 80,0000 人中才有 1 人患病，但一旦发病，孩子从出生或者出生后的几个月就开始遭受折磨，严重的视力丧失、瞳孔异常、眼球震颤、夜盲等症状纷至沓来，让他们的世界从一开始就充满了黑暗。
LCA 的 “个性” 十分复杂，在基因和表现上都呈现出高度的异质性，而且主要以常染色体隐性方式遗传。目前，已经发现超过 25 个基因的突变与它有关，这些基因所编码的蛋白质主要在光感受器和视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium，RPE）中发挥作用，参与光传导、视觉循环、光感受器纤毛运输等重要过程。
其中，由LCA5基因双等位基因致病性变异引起的 LCA，更是 LCA 中的 “狠角色”，属于最严重的类型之一。LCA5基因位于 6 号染色体的 6p14.1 区域，它编码的蛋白质 LCA5/lebercilin 在视网膜中起着至关重要的作用。之前的研究发现，LCA5基因的突变会导致 lebercilin 功能丧失，进而引发一系列问题。在小鼠和斑马鱼模型中，研究人员发现，失去 LCA5 功能会使光感受器迅速退化，外段（Outer Segment，OS）发育不良，视蛋白定位错误等。
虽然针对Lca5gt/gt小鼠模型的研究探索了LCA5基因增强疗法，并且取得了一定成果，比如用 AAV7m8 载体递送人类LCA5基因能够部分挽救小鼠的视网膜结构和视觉功能，相关临床试验也已经开展。但基因疗法并非万能，在某些情况下可能无法达到理想的治疗效果，或者根本无法实施。而且，由于缺乏合适的临床前模型，LCA5基因缺失在人类视网膜模型中的后果还没有得到充分研究。
为了深入了解LCA5基因缺失的影响，找到更多潜在的治疗方法，来自相关研究机构的研究人员展开了一场科研探索之旅。他们在《Acta Neuropathologica Communications》期刊上发表了题为 “CRISPR/Cas9-generated isogenic LCA5 knockout retinal organoids reveal pathogenic mechanisms and rescue by small molecules” 的论文。研究发现，利用基因编辑技术构建的 LCA5 基因敲除（LCA5 KO）视网膜类器官呈现出独特的细胞和分子表型，而植物黄酮类化合物 Eupatilin 和盐酸法舒地尔（Fasudil）这两种小分子物质能够部分挽救这些异常表型。这一研究为 LCA5 相关视网膜疾病的治疗提供了新的思路和潜在的治疗方法，就像在黑暗中为患者点亮了一盏希望之灯。
在这项研究中，研究人员主要运用了基因编辑技术和构建类器官模型这两个关键技术。基因编辑技术就像是一把 “分子剪刀”，研究人员用它精准地对LCA5基因进行编辑；而构建类器官模型则是让研究人员拥有了一个模拟人体视网膜发育的 “小工厂”，在这个 “小工厂” 里观察和研究各种变化。
研究人员首先要做的就是 “打造” 研究工具 —— 构建 LCA5 KO 的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）系。他们运用同时重编程和 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，针对LCA5基因的第 3 外显子进行操作。经过一番努力，成功得到了两个 LCA5 KO 细胞系：LCA5 KO1 和 LCA5 KO2。经过检测，这两个细胞系都出现了预期的基因突变，而且没有明显的脱靶效应。同时，这些细胞系和同基因对照 iPSC 系都表现出多能性，就像一个个充满潜力的 “种子”，为后续实验奠定了基础。
接着，研究人员要把这些 “种子” 培育成视网膜类器官。他们将 LCA5 KO 和同基因对照 iPSC 系分化成 3D 视网膜类器官，这个过程持续了 7 - 8 个月。在这个漫长的过程中，视网膜类器官逐渐发育，呈现出典型的形态变化：在第 30 - 50 天，出现了明显的亮边；到第 120 天，中间变暗，亮边减少；而到了第 150 天左右，对应光感受器内段和外段的刷状缘结构开始出现。通过对不同发育阶段的转录分析，发现早期视网膜分化基因、视杆和视锥富集基因等都有表达，并且成功验证了 LCA5 在对照视网膜类器官中有表达，而在 LCA5 KO 和患者来源的视网膜类器官中则检测不到，这就意味着他们成功构建出了研究所需的模型。
有了模型之后，研究人员开始深入探索 LCA5 缺失会带来哪些影响。他们发现，在 LCA5 KO 视网膜类器官中，LCA5 的定位出现了异常，在对照类器官中，LCA5 沿着轴突或靠近基体分布，而在 LCA5 KO 类器官中却检测不到 LCA5 的信号，这表明基因编辑成功敲除了 LCA5 的表达。
不仅如此，研究人员还发现了其他异常情况。CEP290 和 IFT88 这两种与纤毛功能密切相关的蛋白质，在 LCA5 KO 类器官中的定位出现了显著变化。在正常情况下，CEP290 位于过渡区，IFT88 主要位于纤毛基部，但在 LCA5 KO 类器官中，它们都沿着纤毛积累。研究人员进一步研究发现，虽然其他 IFT 蛋白的定位没有受到影响，但这种变化依然导致了纤毛运输的异常。而且，这种现象在患者来源的 LCA5 JB342 视网膜类器官中也同样存在，这说明这一变化与 LCA5 缺失密切相关。
此外，LCA5 缺失还影响了光感受器外段的发育和视蛋白的定位。通过观察发现，LCA5 KO 和 LCA5 JB342 视网膜类器官的外段明显比对照更短，视蛋白也出现了错误定位，在正常情况下，视蛋白主要位于外段，但在 LCA5 缺失的类器官中，视蛋白在外核层（Outer Nuclear Layer，ONL）出现了错误定位，这一系列变化都严重影响了视网膜的正常功能。
在探索了 LCA5 缺失的影响之后，研究人员开始尝试 “拯救” 这些异常的视网膜类器官。他们选择了 Eupatilin 和 Fasudil 这两种小分子物质进行实验。从第 190 天到第 220 天，用这两种物质或它们的组合处理对照、LCA5 KO 和 LCA5 JB342 患者的视网膜类器官。
实验结果令人惊喜！Eupatilin 和 Fasudil 都能够有效减少 LCA5 KO 类器官中 CEP290 和 IFT88 沿着纤毛的积累，让它们的定位更接近正常水平。同时，这两种物质还显著改善了视蛋白的运输，减少了视蛋白在外核层的错误定位，并且在一定程度上增加了外段的长度。虽然外段长度的增加没有达到统计学意义，但这些结果已经表明这两种小分子物质具有改善 LCA5 缺失导致的异常表型的潜力。
研究人员还深入研究了 LCA5 缺失和小分子处理对基因表达的影响。通过对成熟的 LCA5 KO 和同基因对照视网膜类器官进行批量 RNA 测序分析，发现 LCA5 缺失会导致 214 个基因的表达出现显著差异。而用 Eupatilin 和 Fasudil 处理 LCA5 KO 视网膜类器官后，虽然影响的基因数量和相关通路有所不同，但许多差异表达基因的表达水平都朝着对照水平变化，这说明这两种物质能够部分纠正 LCA5 缺失引起的转录变化。
在蛋白质组学分析中，研究人员发现，LCA5 KO 和对照视网膜类器官之间的差异表达蛋白质和相关通路与转录组学的变化并不重叠。不过，LCA5 KO 和 LCA5 JB342 与对照相比，蛋白质水平的变化具有一定的相关性，这表明这些蛋白质水平的变化与 LCA5 功能丧失有关。
在本次研究中，研究人员利用基因编辑技术和视网膜类器官模型，深入研究了 LCA5 缺失对视网膜的影响，发现了 LCA5 缺失导致的一系列细胞和分子变化，包括纤毛相关蛋白定位异常、视蛋白错误定位、外段发育不良等，并且通过实验证明了 Eupatilin 和 Fasudil 这两种小分子物质能够部分挽救这些异常表型，还能在转录水平上纠正一些变化。
这一研究成果意义重大。一方面，它为我们深入理解 LCA5 相关视网膜疾病的发病机制提供了重要线索，让我们更加清楚地认识到疾病发生发展的过程；另一方面，也为开发新的治疗方法提供了潜在的方向。虽然目前的研究还处于基础阶段，但这些发现为未来治疗 LCA5 相关视网膜疾病带来了新的希望。也许在不久的将来，这些研究成果能够转化为实际的治疗手段，帮助那些被 LCA5 相关视网膜疾病困扰的患者重见光明，让他们的世界不再黑暗。
