联合胶原酶处理与机械加载构建体外软骨损伤模型：评估软骨修复策略的新契机

为解决评估新型软骨修复疗法的问题，研究人员开展了联合胶原酶处理与机械加载构建牛软骨损伤模型的研究。结果显示该模型可模拟软骨损伤，且不同程度处理和加载有不同影响。这为评估修复策略及筛选抗分解药物提供了有效模型。

　　在人体的关节中，软骨就像一层 “减震垫”，默默承受着各种压力，保护着关节。然而，骨关节炎（Osteoarthritis，OA）却像一个 “捣乱分子”，无情地破坏着软骨，严重影响人们的生活质量。目前，对于 OA 的发病机制，科学界还没有完全弄清楚，也缺乏有效的治疗手段来阻止它的发展。在研究 OA 和探索软骨修复方法时，动物实验存在不少问题，比如小鼠和大鼠的软骨薄、自愈能力强，和人类差异大，研究结果很难应用到人体上。而且，随着动物保护理念的发展，减少动物实验的需求也越来越迫切。因此，急需一种可靠的体外模型来评估针对 OA 的治疗策略。

为了解决这些难题，瑞士 AO 研究所以及荷兰乌得勒支大学医学中心的研究人员展开了深入研究。他们成功建立了一种体外软骨损伤模型，通过这个模型可以有效评估新型软骨修复疗法的安全性和有效性。这一研究成果发表在《Arthritis Research & Therapy》杂志上，为骨关节炎的研究和治疗开辟了新的道路。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，从新鲜牛股骨髁获取骨软骨栓（Osteochondral plugs，OC plugs），并在特定的生物反应器平台中培养。其次，使用胶原酶（Collagenase）和聚集蛋白聚糖酶（Aggrecanase）处理 OC plugs 来诱导软骨损伤。然后，利用特定的软骨生物反应器系统对 OC plugs 进行机械加载。最后，通过多种检测方法，如生化分析（测量硫酸化糖胺聚糖（Sulfated Glycosaminoglycans，sGAG）、DNA 和胶原蛋白含量）、染色技术（Safranin O / Fast green 染色、Lactate dehydrogenase（LDH）和 Ethidium homodimer（EthD）染色等）、免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）以及基因表达分析（Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）来评估软骨损伤情况。

下面来看具体的研究结果：

1. 轻度和中度软骨损伤：通过胶原酶 II 处理 5 分钟（CT 组）诱导轻度软骨损伤，再用聚集蛋白聚糖酶 1 和 2 处理 40 分钟（CAT 组）诱导中度损伤。与未处理样本相比，CT 和 CAT 组的 sGAG 在最初两天内大量释放，组织 sGAG 与 DNA 的比值降低。CT 和 CAT 组在第 2 天的胶原蛋白释放量比未处理组低，但 CT 组在第 6 和 7 天有所增加。
2. 静态条件下轻度和中度软骨损伤的组织学证据：Safranin O / Fast green（SO-FG）染色显示，CT 和 CAT 组的 sGAG 减少。LDH 染色表明，两组的软骨细胞活力都较高。免疫组织化学分析发现，CT 组的 COL2A1（Collagen Type II Alpha 1 Chain）染色有所增加，CAT 组则变化不一致；两组的 ACAN（Aggrecan）染色在部分样本中升高，且都出现了聚集蛋白聚糖新表位，说明胶原酶处理激活了内源性聚集蛋白聚糖酶。
3. 炎症和软骨相关标志物的表达：在观察的最初两天，CT 和 CAT 组的 IL-6（Interleukin 6）和一氧化氮（Nitric Oxide，NO）释放显著增加，CT 组的 IL-1β（Interleukin 1β）释放也升高，但之后这些参数恢复正常。两组的 TNF-α（Tumor necrosis factor Alpha）释放没有差异，且损伤组的 ACAN、COL2A1、SOX9、IL6、ADAMTS4（A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs 4）和 ADAMTS5（A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs 5）的 mRNA 表达水平在 7 天内没有明显变化。
4. 10 - 20% 软骨厚度的压缩力和 25 度剪切应力对轻度软骨损伤的影响：对 CT 组施加 10 - 20% 软骨厚度的压缩和 25 度的剪切应力，软骨细胞仍能存活。CT 加载组的 ACAN mRNA 水平有所升高，第 7 天的聚集蛋白聚糖新表位水平也更高。
5. 20 - 40% 软骨厚度的压缩力和 25 度剪切应力的影响：当压缩力增加到 20 - 40% 软骨厚度时，从第 2 天开始，CT 加载组的软骨表面出现细胞死亡，但 TUNEL 染色呈阴性。此时，sGAG 损失更多，COL2A1 染色减少，ACAN 和聚集蛋白聚糖新表位在第 1 和 2 天增加。

研究结论和讨论部分意义重大。研究人员成功建立了一种轻度牛软骨损伤模型，先对软骨进行 5 分钟的胶原酶处理，再施加多轴机械加载。这种加载会加重损伤，还能以依赖加载幅度的方式诱导细胞死亡，模拟了患者关节在机械条件下的早期软骨损伤情况。当施加 20 - 40% 的压缩时，该模型可用于筛选针对组织过载引起的骨关节炎患者的治疗方法。不过，该模型也存在一些局限性，比如炎症反应与实际的慢性炎症有差异，未充分考虑血管生成以及与滑膜组织和液体的相互作用等。但总体而言，这一模型为研究软骨损伤和修复提供了重要的工具，有助于推动骨关节炎治疗领域的发展，为未来开发更有效的治疗方法奠定了基础。