溶瘤腺病毒Adf35（OGN）在叙利亚仓鼠和小鼠体内的生物分布和毒性评价

　　

新型溶瘤腺病毒 Adf35 (OGN) 的安全性与分布特性研究解读

瑞典乌普萨拉大学免疫学、遗传学和病理学系的 Erik Yngve 等研究人员，于 2025 年在《Cancer Gene Therapy》期刊发表了题为 “Biodistribution and toxicity evaluation of oncolytic adenovirus Adf35 (OGN) in Syrian hamster and mouse” 的论文。该研究对新型溶瘤腺病毒 Adf35 (OGN) 在叙利亚地鼠和基因敲除小鼠中的生物分布和毒性进行评估，为其后续进入临床试验提供了重要的安全性数据支持，在肿瘤免疫治疗领域具有关键意义。

一、研究背景

癌症免疫疗法近年来发展迅速，已成为许多临床治疗方案的重要组成部分，旨在增强患者自身的抗肿瘤免疫反应，克服肿瘤免疫逃逸机制。溶瘤病毒作为一种免疫疗法，能够感染并裂解肿瘤细胞，同时释放肿瘤相关抗原以及病原体和损伤相关分子模式，促进肿瘤相关抗原在引流淋巴结的呈递，进而激活肿瘤反应性 T 细胞。

目前，仅有 T-VEC 被批准用于治疗转移性和不可切除的恶性黑色素瘤，但针对其他溶瘤病毒治疗不同类型癌症的临床试验正在广泛开展。腺病毒因其良好的安全性，常被用作溶瘤病毒，其副作用通常较为温和且短暂。

Adf35 (OGN) 是一种新型溶瘤腺病毒，它携带来自猪的 α-1,3 - 半乳糖基转移酶（GGTA1）和幽门螺杆菌的中性粒细胞激活蛋白（NAP）这两种免疫刺激转基因。其中，α-1,3 - 半乳糖基转移酶可合成 α-gal，由于人类缺乏该糖基化结构，体内存在天然的抗 α-gal 抗体，α-gal 成为强大的免疫激活剂；幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白能吸引并激活中性粒细胞和单核细胞，促进 Th1 极化的抗肿瘤 T 细胞反应。Adf35 (OGN) 有望逆转实体瘤的免疫抑制微环境，增强对肿瘤特异性新抗原的免疫监视，刺激细胞毒性肿瘤反应性 T 细胞的扩增，从而杀伤肿瘤细胞。

在新的溶瘤腺病毒进入临床试验前，需要进行临床前安全性研究。叙利亚地鼠是研究溶瘤腺病毒动力学、生物分布和毒性的常用啮齿动物模型，因其细胞系中腺病毒的复制效果与人类细胞系相近；而 GGTA1 基因敲除小鼠缺乏 α-gal 的表达，可用于评估 Adf35 (OGN) 中 α-gal 表达相关的毒性，模拟人体存在抗 α-gal 抗体的情况。

二、研究材料与方法

（一）实验材料

Adf35 (OGN) 病毒的骨干来自野生型 5 型腺病毒，通过替换纤维结节，使其能通过与 CD46 的相互作用进入肿瘤细胞，同时 E1A 基因的 24bp 缺失和 E1B 基因的完全缺失，使其在正常细胞中无法复制，却能在肿瘤细胞中复制，并携带两种免疫刺激转基因。研究中使用了符合 GMP 标准的 Adf35 (OGN)，部分实验组使用了实验室级别的 Adf35 (OGN) 。Adf35 (Mock) 作为非复制对照病毒，Adf35 (Luc) 作为阴性对照病毒，实验还使用了缺失转基因的 Adf35 (O)、仅含 α-gal 的 Adf35 (OG) 和仅含 HP-NAP 的 Adf35 (ON) 。

实验动物选用 7 周龄的叙利亚地鼠和 C57BL/6 背景的 GGTA1 基因敲除小鼠。叙利亚地鼠购自 Janvier-Labs，饲养于瑞典兽医局；GGTA1 基因敲除小鼠由首尔国立大学 Park 博士实验室馈赠，饲养于乌普萨拉大学 Rudbeck 实验室动物设施。实验动物均在受控气候条件下饲养，自由饮食和饮水，并对饲养环境进行了丰富化处理。

（二）实验方法

1. 动物分组与处理：叙利亚地鼠随机分为多个处理组，每组包含 3 只雄性和 3 只雌性。分别接受 PBS、Adf35 (Mock) 或不同剂量（或VP/kg）的 Adf35 (OGN) 皮下注射，部分组接受两次注射（分别在第 0 天和第 21 天），部分组接受三次注射（分别在第 1 天、第 17 天和第 31 天） ，并在不同时间点（第 24 天或第 42 天）安乐死。GGTA1 基因敲除小鼠在免疫接种 α-gal 后植入胰腺导管腺癌细胞（Panc02-KO），当肿瘤可触及时，每组 2 只小鼠接受 PBS 或不同类型的 Adf35 病毒（VP / 只）瘤内注射，当肿瘤体积达到时安乐死并收集器官。

2. 样本采集：在不同时间点收集叙利亚地鼠的生物流体（粪便、尿液、唾液）、血液和组织样本；收集 GGTA1 基因敲除小鼠的心脏、肺、脾、肝、肾等器官样本。收集的样本部分用于生物分布分析，部分固定用于组织病理学分析。

3. 检测指标与方法：采用 ELISA 法检测血清中抗腺病毒 IgG 抗体水平，评估体液免疫反应；收集血液进行全血细胞分析和血清生化分析，检测血红蛋白、白细胞、血小板等血细胞计数以及丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶等生化指标；运用 qPCR 技术检测组织和生物流体中的病毒基因组拷贝数，确定病毒的生物分布；对组织样本进行固定、石蜡包埋、切片和苏木精 - 伊红染色，通过光学显微镜观察组织病理学变化。

4. 数据分析：使用 R 软件进行数据分析，非参数检验用于评估组间差异，Kruskal-Wallis 检验用于检测血液学、生化参数和抗腺病毒滴度的组间差异，若存在显著差异则进一步使用 Dunn's 检验，并使用 Bonferroni 校正 P 值以校正多重检验。此外，还将对照组和处理组合并，使用 Mann-Whitney U 检验进行分析，被认为具有统计学意义，生物分布和脱落数据未进行统计分析。

三、研究结果

（一）Adf35 (OGN) 未引起明显不良反应

在整个实验过程中，通过视觉观察，叙利亚地鼠和 GGTA1 基因敲除小鼠在接受病毒重复注射后，均未出现不良反应或不适迹象，表明 Adf35 (OGN) 具有良好的耐受性。

（二）Adf35 (OGN) 在主要器官中未复制

对 451 个组织样本进行 qPCR 分析，仅有 15 个样本检测到高于检测限（LOD）的病毒颗粒，且主要分布在乳腺 / 皮肤、心室、脾脏、骨髓和膀胱等部位，病毒数量较低。PBS 和 Adf35 (Mock) 组未检测到高于 LOD 的样本。Adf35 (OGN) 处理组中，高剂量组阳性样本数多于低剂量组，但两次注射和三次注射组之间无差异。早期终止组的阳性样本数多于晚期终止组，表明病毒颗粒逐渐从组织中清除。这说明局部注射 Adf35 (OGN) 后，病毒在体内的全身传播有限，且在研究的组织中无明显复制，可能与病毒颗粒进入全身循环缓慢、E1 基因突变以及抗病毒抗体有关。

（三）Adf35 (OGN) 未引起显著的病毒脱落

对 384 个生物流体样本（粪便、尿液、唾液）分析发现，仅有 8 个样本检测到病毒颗粒，其中 7 个样本在注射后 1 或 3 天收集，第 21 天仅 1 个阳性样本。阳性样本多来自不同动物，且病毒数量普遍较低，最大值为 121 VP / 仓鼠基因组拷贝。表明重复局部注射 Adf35 (OGN) 不会导致显著的病毒脱落，降低了病毒传播到环境和引发二次感染的风险。

（四）Adf35 (OGN) 刺激体液抗病毒反应

病毒注射刺激了抗腺病毒 IgG 抗体的产生，早期终止组和晚期终止组均可检测到该抗体，且不同处理组（Adf35 (Mock) 和 Adf35 (OGN)）、不同剂量（和VP/kg）以及不同注射次数（两次或三次）产生的 IgG 水平相似，说明 Adf35 (OGN) 能够刺激机体产生体液免疫反应。

（五）Adf35 (OGN) 不影响血液学和生物化学指标

血液分析结果显示，与未处理和 PBS 注射的对照组相比，病毒处理组的血液学和生物化学参数（如血红蛋白、白细胞计数、转氨酶等）均无统计学显著差异。尽管部分病毒处理组的个别值（主要是 ALT 和 AST）超出对照组范围，但多因溶血导致，总体表明 Adf35 (OGN) 局部给药对血液学和生物化学稳态影响较小。

（六）Adf35 (OGN) 未引起叙利亚地鼠组织病理学改变

组织病理学分析发现，叙利亚地鼠部分肝脏活检样本存在门周或小叶单核细胞浸润，但在所有组（包括未处理组）中均有出现，与处理或剂量无关，属于偶然发现。心脏、前列腺和肾脏等器官的一些变化也被认为与处理无关，其他器官未观察到明显变化，说明 Adf35 (OGN) 不会引起叙利亚地鼠组织病理学改变。

（七）Adf35 (OGN) 未引起 GGTA1 基因敲除小鼠组织病理学改变

在 GGTA1 基因敲除小鼠模型中，接受不同处理（PBS、Ad35 (Luc)、Adf35 (O)、Adf35 (OG)、Adf35 (ON) 和 Adf35 (OGN)）的小鼠，在大脑、心脏和肺等器官未观察到明显的组织病理学变化。部分小鼠在心室、肝脏、脾脏和肾脏出现轻微的炎症细胞浸润、细胞肥大或造血现象，但这些变化在各处理组中相似，可能由免疫接种和肿瘤植入引起，而非病毒处理所致。

四、研究结论与讨论

本研究全面评估了 Adf35 (OGN) 的安全性、毒性和生物分布，结果表明该病毒具有良好的安全性。在组织复制方面，病毒在组织中的复制水平较低，仅少量样本检测到病毒颗粒，且血液、血清和肝脏均为阴性，表明其全身传播受限；环境脱落方面，病毒在生物流体中的检测率低，减少了传播到环境和引发二次感染的风险；血液稳态方面，未对血液学和生物化学指标产生显著影响；组织病理学方面，未引起与处理相关的组织改变。

尽管在研究中偶尔观察到 ALT 和 AST 水平升高，但未伴随严重的肝脏组织病理学变化，其生物学意义较低。同时，增加注射次数的强化治疗方案未改变整体实验结果，说明重复给药具有良好的耐受性。

GGTA1 基因敲除小鼠模型虽存在一定局限性，但仍是研究转基因相关毒性的有效模型。在该模型中，Adf35 (OGN) 重复瘤内注射未引起主要器官的病变和改变。不过，要全面评估 Adf35 (OGN) 的安全性，仍需依赖人体临床试验数据。

本研究为 Adf35 (OGN) 进入临床剂量递增研究提供了重要的临床前数据支持，有望推动其成为一种安全有效的癌症治疗药物，为肿瘤免疫治疗领域带来新的突破，为癌症患者提供更有前景的治疗选择。