对来自心律失常性心肌病患者的效应/记忆调节性T细胞的分析发现，IL-32是ACM发病机制中的一个新参与者

　　

心律失常性心肌病免疫细胞新发现：IL-32 或成治疗新靶点

来自法国图卢兹 1I2MC（INSERM，UMR - 1297）等多个单位的研究人员，在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Analysis of effector/memory regulatory T cells from arrhythmogenic cardiomyopathy patients identified IL-32 as a novel player in ACM pathogenesis” 的论文。这一研究首次全面表征了心律失常性心肌病（ACM）患者循环免疫细胞，揭示了调节性 T 细胞（Treg）的变化以及白细胞介素 32（IL - 32）在疾病进程中的关键作用，为深入理解 ACM 发病机制和开发新的治疗策略提供了重要依据。

研究背景

ACM 是一种遗传性心脏疾病，可导致年轻人尤其是运动员发生心源性猝死和进行性心力衰竭。多数情况下，它由编码桥粒蛋白的基因常染色体显性突变引起，这些蛋白对心肌细胞间的电机械偶联和细胞内信号通路至关重要。ACM 患者心脏存在广泛的心肌细胞死亡和纤维脂肪组织替代，主要发生在右心室，进而引发心律失常和收缩功能障碍。

炎症是 ACM 的一个重要特征，在疾病的不同阶段，心脏活检和尸检中常能观察到炎性细胞浸润，且炎症程度与疾病严重程度相关。中性粒细胞、T 淋巴细胞和巨噬细胞等炎性细胞在心脏血管及其周围出现，提示其从循环系统募集并激活。以往认为，桥粒功能障碍导致的心肌细胞死亡是 ACM 的初始事件，但近期研究表明，心脏内先天免疫反应的激活才是主要驱动机制，ACM 患者心脏表达大量炎性细胞因子和趋化分子，吸引免疫细胞聚集，同时患者血浆中促炎细胞因子和趋化因子水平也较高，还存在自身抗体，提示自身免疫在疾病发生中起作用。

尽管免疫细胞在维持心脏稳态中发挥着重要作用，但此前尚未对 ACM 患者循环免疫 T 细胞亚群进行全面表征，免疫细胞衍生的细胞因子对心脏间质干细胞（C - MSC）特性的调节也有待研究。

研究材料与方法

研究对象

研究共招募了 36 例 ACM 患者，均来自意大利米兰的 Centro Cardiologico Monzino。患者的 ACM 诊断经临床、影像学、解剖病理学和基因检测结果确认。同时选取了年龄和性别匹配的健康供者作为对照，这些供者经检测 HIV、HBC、HCV 均为阴性。

样本采集

从 ACM 患者右心室获取样本，在患者常规实验室检测时采集约 20ml 静脉血，健康供者的血液样本来自法国图卢兹的 Etablissement Fran?ais du Sang Toulouse。

主要实验方法

1. 外周血单个核细胞（PBMC）分离：采用 Ficoll Paque 密度梯度离心法分离 PBMC，分离后进行冻存备用。

2. 原代心脏间质干细胞培养与处理：从心室样本中分离 C - MSC，培养在特定的生长培养基中，实验时用 20ng/mL 的重组 IL - 32γ 处理 3 天。

3. 诱导多能干细胞向心肌细胞分化：将未分化的人诱导多能干细胞（hiPSC）通过特定的诱导方案分化为心肌细胞（iPSC - CM）。

4. 流式细胞术与细胞分选：用多色流式细胞术分析 PBMC 的表型，用相应抗体标记细胞，通过 Live - Dead Yellow 评估细胞活力，在 LSR Fortessa 上进行检测，用 FlowJo 分析数据。通过染色和条形码标记对记忆 CD45RO + CCR4 + CD25 + CD4 + T 细胞进行分选。

5. 单细胞 RNA 测序：对分选的细胞进行单细胞 RNA 测序，用 Single - Cell 3′试剂试剂盒 v2 将细胞分区，构建文库后在 Illumina Nova - Seq 6000 系统上测序，对数据进行预处理、质量控制、归一化和整合等分析，原始数据存储在 GEO 数据库（GSE262428）。

6. 定量实时荧光定量 PCR：提取总 RNA，进行逆转录和实时荧光定量 PCR 反应，用特定引物对检测基因表达，结果以 GAPDH 和 36B4 为内参进行归一化分析。

7. 组织和细胞免疫荧光：对 ACM 患者和对照样本的右心室心肌活检切片进行免疫荧光检测，对 C - MSC 进行固定和染色，用共聚焦显微镜采集图像，用 ImageJ 软件分析荧光信号。

8. 人血浆样本中 IL - 32 定量：用 ELISA 试剂盒检测 ACM 患者和对照者血浆中 IL - 32 的水平。

9. 统计分析：连续变量以均值 ± 标准误表示，分类数据以计数和比例表示。根据数据分布情况选择合适的统计检验方法，p < 0.05 为具有统计学意义，使用 GraphPad Prism 9 进行统计分析和绘图。

关键技术路线

首先对 ACM 患者和健康对照者的外周血免疫细胞进行流式细胞术分析，探究免疫细胞亚群的差异。接着对记忆 Treg 细胞进行单细胞 RNA 测序，分析其转录谱和细胞亚群特征。然后检测 IL - 32 在 PBMC、血浆和心脏组织中的表达情况。最后用重组 IL - 32γ 处理 C - MSC，观察其对脂质积累和胶原沉积的影响。

研究结果

1. ACM 患者血液中免疫细胞群体分析

通过流式细胞术分析发现，与健康对照相比，ACM 患者血液中自然杀伤（NK）细胞数量减少；经典单核细胞表面标记物表达异常，非经典单核细胞 CCR2 表达升高，经典单核细胞 HLA - DR 和 CD86 表达降低，提示抗原呈递能力受损和单核细胞失能。

在 T 细胞亚群方面，ACM 患者 CD8 T 细胞中，初始 CD8 T 细胞比例升高，终末分化记忆 EMRA CD8 T 细胞比例降低，表明初始 CD8 T 细胞向记忆表型的转化受阻；CD4 T 细胞中，Th1 样 CD4 + T 细胞频率降低，而其他效应记忆 CD4 T 细胞亚群无显著差异，且与 Th1 细胞功能相关的转录因子 TBX21 表达降低。此外，ACM 患者中效应 / 记忆 FOXP3 + CCR4 + CD45RO + 调节性 CD4 T 细胞（mTreg）比例显著增加，且其 FOXP3 表达更高。

2. ACM 患者和健康对照者记忆 Treg 的单细胞 RNA 测序

对 5 例 PKP2 突变的 ACM 患者和 5 例年龄、性别匹配的健康对照者的记忆 Treg 细胞进行单细胞 RNA 测序，共分析了 7857 个细胞。结果显示，记忆 CD4 T 细胞可分为 6 个不同的簇，不同簇在 ACM 患者和健康对照者中的分布存在差异。

通过伪时间分析确定了三个分化途径，其中轨迹 1 与效应 / 记忆 Treg 的分化相关，涉及组织驻留标记物的上调和多个信号通路的激活；轨迹 2 和 3 分别通向不同功能的簇，与细胞激活和免疫调节相关。

差异分析表明，ACM 患者 mTreg 中与 IL - 12 信号通路、Th1 抑制、心肌纤维化相关的基因表达上调，同时细胞迁移和黏附相关的通路也被激活；而调节 Treg 浸润和保留、Th17 抑制等关键通路的基因表达下调。

3. ACM 患者和健康对照者 PBMC、血浆和右心室中 IL - 32 的表达

通过分析发现，IL - 32 是 ACM 患者记忆 Treg 中表达上调最明显的分泌因子。在 PBMC 中，ACM 患者 IL - 32 的 mRNA 水平更高，且 CD4 T 细胞中 IL - 32 阳性的效应 Treg 频率也更高；血浆中，ACM 患者 IL - 32 浓度显著高于健康对照；在心脏组织中，ACM 患者右心室的 IL - 32 表达水平明显高于健康对照，且主要表达于白细胞和淋巴细胞中。

4. IL - 32 对 C - MSC 脂肪生成和纤维化的影响

用重组 IL - 32γ 处理 C - MSC 后发现，在基础条件下，ACM 患者和健康对照者的 C - MSC 积累的脂质和胶原相似，但 IL - 32γ 处理 3 天后，ACM 患者 C - MSC 的脂质积累和胶原沉积显著增加，而健康对照者的 C - MSC 对 IL - 32γ 刺激无明显反应。用 IL - 32γ 处理 ACM 患者诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC - CM），对其收缩性参数无显著影响。

研究结论与讨论

该研究首次发现 ACM 患者循环免疫细胞亚群发生改变，mTreg 数量增加且具有免疫抑制表型，有助于限制免疫反应和支持组织修复。IL - 32 在血液和组织样 Treg 亚群中高表达，通过促进脂质沉积和胶原积累，加速 ACM 患者心脏重塑和功能障碍，有望成为治疗 ACM 纤维脂肪病变的新靶点。

ACM 患者外周血单个核细胞亚群发生改变，如 EMRA CD8 + T 细胞减少、经典单核细胞抗原呈递功能减弱，提示慢性低度炎症可能阻碍初始 CD8 T 细胞向记忆细胞转化，同时 Th1 样 CD4 T 细胞、NK 细胞和 EMRA CD8 T 细胞数量减少，表明机体存在对 1 型免疫反应的代偿性抑制。

mTreg 在 ACM 患者中比例增加且 FOXP3 表达升高，增强了其免疫抑制功能。Treg 在调节免疫反应、维持组织稳态和修复中发挥着关键作用，在 ACM 患者中，Treg 可能试图抑制自身免疫反应，以应对遗传损伤引发的过度免疫激活。但与扩张型心肌病和肥厚型心肌病不同，ACM 患者 Treg 的变化暗示了免疫反应的基因特异性调节。

单细胞转录组分析显示，ACM 患者 mTreg 的激活状态增强，由细胞因子或 TCR 激活介导，这表明抗原依赖和非依赖的反应都可能强化其抑制活性。其中，效应 Treg 中 FOXP3 表达较高，具有组织驻留样 Treg 的特征，可能在损伤组织修复中发挥重要作用。

IL - 32 作为一种促炎细胞因子，在多种疾病中发挥作用。在 ACM 患者中，IL - 32 在 mTreg 中高表达，且其 γ 异构体具有最强的活性。IL - 32 不仅能促进 C - MSC 的脂肪生成和纤维化，还与心脏重塑和不良预后相关，提示其在 ACM 发病机制中起重要作用。

该研究为理解 ACM 发病机制提供了新视角，为开发针对 ACM 的治疗策略奠定了基础。未来可进一步研究靶向 IL - 32 或调节 Treg 功能的治疗方法，以改善 ACM 患者的预后。