NF-κB RelB通过与RelA竞争结合靶基因启动子来抑制树突状细胞的炎症基因表达程序

　　

NF-κB RelB 研究新进展：抑制树突状细胞炎症基因表达的机制及意义

近日，来自美国加利福尼亚大学洛杉矶分校（University of California, Los Angeles）微生物学、免疫学和分子遗传学系等多个部门的研究人员，在《Cell Discovery》期刊上发表了题为 “NF-κB RelB suppresses the inflammatory gene expression programs of dendritic cells by competing with RelA for binding to target gene promoters” 的研究论文。该研究在揭示自身免疫性疾病发病机制方面取得重要进展，为相关疾病的治疗提供了潜在的新靶点和理论依据。

论文的第一作者为 Héctor I. Navarro，通讯作者是 Jennifer J. Chia 和 Alexander Hoffmann。研究聚焦于 NF-κB 信号通路中 RelB 亚基在树突状细胞（DCs）炎症基因表达调控中的作用，对深入理解自身免疫性疾病的发生发展机制具有关键意义。

一、研究背景

当前研究表明，全球约 5%-8% 的人口受自身免疫性疾病困扰，同时还有 40 多种遗传性自身炎症性疾病被发现。核因子 κB（NF-κB）信号通路在免疫反应中至关重要，与多种自身免疫和自身炎症性疾病密切相关 。NF-κB 家族包含 RelA、cRel、RelB、p52 和 p50 等多个亚基，它们形成不同的二聚体，在细胞功能调节中发挥关键作用。

在小鼠实验中，RelB 亚基基因缺失会引发多器官炎症病变，包括肺部和肝脏的混合炎症细胞浸润、脾肿大和胸腺萎缩等。此前研究发现，携带 RELB 基因突变导致 RelB 蛋白完全缺失的患者，其成纤维细胞和 DCs 中干扰素（IFN）刺激基因（ISG）表达失调。然而，IFN 信号通路的基因敲除并不能改善 RelB 缺陷小鼠的关键病理特征，这表明 RelB 缺陷导致的病理可能并非由 IFN 信号异常主导，而是与 NF-κB 驱动的促炎基因表达失调有关。

虽然已知 RelB 对基因表达有激活和抑制作用，且可能通过多种机制参与基因调控，但在 RelB 缺陷的患者和小鼠中，其导致自身免疫的具体机制仍不明确。由于 DCs 在自身免疫疾病中作用关键，且 RelB 在健康小鼠和人类 DCs 中高表达，研究人员旨在探究 RelB 在 DCs 中抑制炎症基因表达的具体机制。

二、研究材料与方法

（一）设计 RelB DNA 结合突变体

研究人员通过 PCR 扩增小鼠 RelB cDNA 编码区，构建含 RelB 变体的 pBABE-puro 载体，利用定点突变技术在 RelB 的氨基末端引入单氨基酸或三氨基酸替换突变（R117A、Y120A 和 E123A），构建出 RelB DNA 结合突变体。

（二）细胞系构建

将携带 RelB 突变体的逆转录病毒载体转染到 Plat-E 包装细胞，收集病毒上清感染 RelB 和 nfkb2 双敲除的成纤维细胞，经嘌呤霉素筛选获得稳定表达 RelB 突变体的细胞系。同时设置空载体和野生型 RelB 载体作为对照。

（三）生化分析

采用蛋白质免疫印迹（Western blotting）和电泳迁移率变动分析（EMSA）对 RelB DNA 结合突变体进行生化特性分析。Western blotting 检测 RelB 蛋白表达水平，EMSA 用于评估 RelB 与 DNA 的结合能力。

（四）小鼠模型构建

利用定点敲入技术构建 RelB DNA 结合突变小鼠（RelB）。通过同源重组将编码突变 RelB 蛋白的供体序列导入胚胎干细胞，获得携带 Neo 抗性标记的细胞系，植入后产生杂合子小鼠。再通过与表达 Flp 重组酶的小鼠杂交去除抗性标记，经回交和杂合子交配获得纯合子 RelB小鼠。

（五）小鼠饲养与细胞培养

野生型（WT）、基因敲除和敲入小鼠均饲养于无病原体环境。从鼠股骨分离骨髓细胞，添加 GM-CSF 和 IL-4 培养获得骨髓来源的树突状细胞（BMDCs），并分别用 CpG 或 Poly (I:C) 刺激，在不同时间点收集细胞用于后续实验。

（六）转录组分析与 ChIP 实验

提取 RNA 进行 RNA 测序（RNA-seq），构建文库并测序，利用生物信息学方法分析基因表达变化。同时进行染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），使用抗 RelA 或 RelB 抗体富集与蛋白结合的 DNA 片段，测序后分析 RelA 和 RelB 在基因组上的结合位点。

（七）组织分析

对小鼠的脾脏、肺和肝脏等组织进行分离、固定、切片和 H&E 染色，由专业人员进行盲法评分，评估组织病理变化，包括炎症细胞浸润、组织萎缩和增生等情况。

三、研究技术路线

研究人员首先构建了 RelB 基因敲除小鼠和 RelB DNA 结合突变小鼠模型，通过转录组测序和染色质免疫沉淀测序，分析野生型、RelB 基因敲除及突变小鼠的 BMDCs 中基因表达和 RelA、RelB 的结合位点变化。同时，利用生化实验检测 RelB 突变体的 DNA 结合能力，综合组织病理学分析和细胞因子检测，全面探究 RelB 抑制炎症基因表达的机制及在自身免疫性疾病中的作用。

四、研究结果

（一）RelB小鼠炎症病理特征与 IFN 无关

研究人员通过构建 IFNARRelB双敲除小鼠，观察其生长、器官病理变化和血清细胞因子水平。结果显示，双敲除小鼠与 RelB小鼠类似，存在生长迟缓、脾肿大、胸腺萎缩以及肺部和肝脏的混合炎症细胞浸润，且这些病理特征并未因 IFN 信号通路的敲除而改善。这表明 RelB 缺陷导致的病理主要不是由 IFN 信号异常引起，而是独立于 IFN 信号的。

（二）RelB 缺失导致 RelA 在基因组 RelB 结合位点的结合增加

对 RelB和 WT 小鼠的 BMDCs 进行 ChIP-seq 分析，研究人员发现虽然大多数 RelA DNA 结合事件在 RelB 缺失时未改变，但部分在野生型中被 RelB 结合的 NF-κB 结合位点，在 RelB 缺失时 RelA 的结合增加。通过对 RelA 结合位点的聚类分析，发现 Cluster A 中 RelA 结合在 RelB BMDCs 中显著升高，且该簇基因的 GO 分析显示与 NF-κB 信号转导、先天免疫反应和炎症反应相关。这表明 RelA 和 RelB 可能在基因组上竞争结合 NF-κB 结合元件，影响炎症相关基因的调控。

（三）RelA 与启动子区域结合增加与基因表达上调相关

研究人员将 RelA 结合事件注释到最近的基因，并筛选出因 RelB 缺失而结合增加且与刺激反应相关的结合事件。通过与 RNA-seq 数据结合分析，发现 98%（117 个中的 98 个）先前报道的在 RelB BMDCs 中高表达的 IFN 非依赖性 NF-κB 促炎基因，位于 RelA 结合增加且基因高表达的右上象限。同时，在 RelB中高表达基因的调控区域，RelA 结合显著增加。这进一步证实了 RelA 和 RelB 竞争结合位点，且 RelB 缺失时，高表达的促炎基因其启动子区域附近 RelA 结合增加。

（四）RelB DNA 结合结构域靶向突变体显示自身免疫病理

构建的 RelB突变小鼠出现生长迟缓、体型较小、驼背、皮肤鳞屑、腹部肿大、脾肿大和胸腺萎缩等类似 RelB小鼠的自身免疫病理特征。对其组织进行病理分析，发现肺部有中度至重度的血管周围炎症，肝脏有中度至重度的门周和小叶中心炎症浸润，血清中促炎细胞因子 IP-10 和 IL-6 水平升高。这表明 RelB 的 DNA 结合功能对抑制自身免疫病理至关重要，失去该功能会导致类似 RelB 完全缺失的病理表型。

（五）RelB DNA 结合突变的 DCs 过度激活促炎基因表达

研究人员比较了 WT、RelB、RelB、IFNAR、IFNARRelB和 IFNARRelB小鼠来源的 BMDCs 在刺激后的基因表达情况。通过 RNA-seq 和聚类分析，发现 Cluster A 基因是 IFN 非依赖性促炎基因，在所有含 RelB 缺失的基因型中均高表达，在 RelB和 IFNARRelB小鼠的 BMDCs 中也呈现高表达，且这些基因的 motif 分析显示 NF-κB 是主要富集基序。这表明 RelB 通过直接结合 DNA 并与 RelA 竞争 κB 位点，抑制 IFN 非依赖性促炎基因的表达。

五、研究结论与讨论

（一）研究结论

本研究表明，RelB 缺陷导致的病理是 IFN 非依赖性的。RelB 通过与 RelA 竞争结合靶基因启动子区域的 κB 位点，抑制 DCs 中促炎基因的表达。RelB DNA 结合功能缺失会导致类似 RelB 完全缺失的表型，包括多器官炎症病理和促炎基因的过度表达。这揭示了 RelB 在调节 DCs 炎症反应和维持免疫平衡中的重要作用机制。

（二）讨论

虽然研究明确了 RelB 与 RelA 竞争结合位点是抑制促炎基因表达的关键机制，但 RelB 结合 DNA 后的具体功能以及其在细胞质中的作用仍有待进一步研究。此外，研究主要在 DCs 中进行，而 RelB 在其他免疫细胞中的功能以及对整体免疫调节的影响还需要深入探索。尽管如此，该研究为理解自身免疫性疾病的发病机制提供了新的视角，提示针对 NF-κB 信号通路中 RelB - RelA 相互作用的精准调控，可能成为治疗 RelB 缺陷相关自身免疫性疾病和其他自身免疫性疾病的潜在策略，为后续的药物研发和临床治疗提供了重要的理论基础。