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重组腺相关病毒载体（rAAV）是临床 DNA 递送的重要平台，但存在基因负载量小的问题。研究人员开展了双 AAV 载体转导相关研究，发现同源重组（HR）抑制双载体转导，抑制 HR 可提高转导效率。这为 rAAV 基因治疗提供了新方向。
在基因治疗的广阔领域中，重组腺相关病毒载体（rAAV）堪称一颗闪耀的 “明星”，它凭借诸多优良特性，成为临床 DNA 递送的热门选择。rAAV 源自人类细小病毒，具有免疫原性低、安全性高、能长期稳定表达等优点，这让它在人类基因治疗的舞台上备受瞩目。然而，就像再完美的美玉也有瑕疵一样，rAAV 也面临着一个重大挑战 —— 有限的 DNA 携带能力。
rAAV 那小小的、无包膜的 25nm 衣壳，就像一个空间有限的 “小盒子”，最多只能容纳 5kb 的单链 DNA（ssDNA）。这一限制如同给基因治疗戴上了沉重的 “枷锁”，使得许多较大的基因，比如用于治疗杜氏肌营养不良症的抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因，以及最新的精准基因编辑工具如最准确版本的 Cas9 和碱基编辑器等，都无法被顺利包装进 rAAV 载体，从而无法应用于相关的基因治疗中。不仅如此，当前常用的启动子，如巨细胞病毒（CMV）启动子，虽然能强力驱动基因表达，但它在体内广泛表达，就像一个不受控制的 “广播”，会导致在非治疗相关组织中出现脱靶表达，过高的转基因表达水平甚至可能引发免疫反应，让治疗功亏一篑。因此，如何突破 rAAV 的基因负载限制，提高其转导效率，成为了基因治疗领域亟待攻克的难题。
为了打破这一困境，来自美国加利福尼亚大学伯克利分校（University of California, Berkeley）等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们深入研究双 AAV 载体转导机制，旨在找到提升其效率的有效方法。经过一系列严谨的实验和深入的分析，他们取得了令人振奋的成果：发现同源重组（HR）对双载体转导具有抑制作用，通过抑制 HR 相关因子 BRCA1 和 Rad51，能够显著增加 rAAV 载体的连接和表达，从而大幅提升双载体转导效率。这一发现为 rAAV 基因治疗开辟了新的方向，有望让更多患者受益于基因治疗的神奇力量。该研究成果发表在《Nature Communications》上。
在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过构建双载体系统和基于慢病毒的布鲁内洛（Brunello）文库，进行全基因组敲除（KO）筛选，以识别影响双载体转导的宿主细胞调节因子。其次，利用染色质免疫沉淀 - 定量聚合酶链反应（ChIP - qPCR）技术，检测 rAAV 载体基因组与组蛋白的结合情况以及相关蛋白的富集。此外，还借助高内涵成像技术，对细胞内的 rAAV 载体基因组的连接和表达进行定量分析 。
研究结果
- 全基因组筛选确定细胞抑制因子：研究人员构建了适用于全基因组筛选的平台，用慢病毒布鲁内洛文库转导 U2 - OS 细胞，再用双载体共转导。通过筛选和分析，发现 DNA 合成和修复途径，尤其是同源定向修复（HDR）在抑制双载体转导中起重要作用。
- 载体基因组被识别为双链断裂：通过免疫染色和 ChIP - qPCR 实验，发现 rAAV 载体基因组在进入细胞脱壳并转化为双链 DNA（dsDNA）后，会迅速与组蛋白结合，并被宿主细胞标记为双链断裂（DSB），同时招募 DSB 修复因子，且 HDR 相关因子 BRCA1 比非同源末端连接（NHEJ）相关因子 53BP1 更易与载体基因组共定位。
- HDR 缺陷增加 rAAV 载体的连接和表达：通过 CRISPR/Cas9 敲除 BRCA1、siRNA 敲低 BRCA1 和 Rad51 以及使用药物 B02 抑制 Rad51 等实验，发现抑制 HDR 可增加 rAAV 载体的连接、新的附加体形成和转基因表达，且增加的效果并非源于载体基因组数量的增加。
- ATM 和 ATR 抑制增加转基因表达：分别抑制 ATM 和 ATR 激酶，发现 ATM 抑制可减少 γH2AX 与载体基因组的共定位，而 ATR 抑制对其无影响，但二者都能增加转基因表达，且 ATR 抑制对转导的影响可能不依赖于 γH2AX。
- Rad51 抑制增加转录活性载体基因组比例：用 MS2 阵列替换 mScarlet 基因，观察转录活性。发现 Rad51 抑制可增加转录活性载体基因组的比例，且抑制 Rad51 能显著提高双载体转导效率，在低载体剂量下效果更明显。
- AP 片段通过非 HR 途径增加连接：研究发现，AP 片段虽能提高双载体转导效率，但抑制 HDR 对含 AP 片段的混合（HB）双载体和传统转拼接（TS）双载体转导影响相似，表明 AP 并非主要通过 HR/HDR 发挥作用，且 NHEJ 对 ITR - ITR 连接起正向调节作用。
- 阻断 HDR 增加 NHEJ 驱动的连接：实验表明，阻断 HDR 后，NHEJ 介导的连接作用增强，53BP1 与载体基因组的共定位增加，进一步证明 HDR 抑制会促使 NHEJ 在载体基因组连接中发挥主导作用。
研究结论与讨论
该研究揭示了宿主细胞对 rAAV 载体转导的关键调控机制，提出了一个全新的宿主 - 载体相互作用和通路决策模型。在 rAAV 载体脱壳后，其双链 DNA 基因组会迅速与组蛋白结合并被标记为双链断裂，HDR 因子优先被招募，但它在连接过程中效率较低。而抑制 HDR 后，更高效的 NHEJ 得以发挥作用，促进载体基因组连接，进而提高双载体转导效率。这一发现为解决 rAAV 基因治疗的瓶颈问题提供了重要理论依据和实践方向。
从临床应用角度来看，通过短暂抑制 HDR，能在较低载体剂量下实现与高剂量载体相当的转导水平，这大大降低了基因治疗中高剂量载体可能带来的毒性风险，为基因治疗的安全性提供了有力保障。此外，对于一些 HDR 调控异常的疾病，如 BRCA 缺陷型癌症，或许可以利用这一特性，在特定情况下为 rAAV 临床应用带来新的机遇。
不过，研究也存在一些局限性。比如，无法确定 rAAV 载体基因组是主动招募修复因子，还是被招募到宿主基因组的损伤修复位点；也不清楚载体基因组进入细胞后是立即活跃表达，还是默认处于抑制状态，需要解除抑制才能激活。这些问题为后续研究指明了方向，期待未来能有更多深入的探索，进一步完善 rAAV 基因治疗的理论和技术体系，让基因治疗更好地造福人类健康。
