在蛋白质相互作用网络中，隐性遗传变异决定了基因复制的命运

随着时间的推移，同源基因在其序列中积累了不影响其功能的变化，这被称为隐变。使用旁系肌球蛋白，本研究显示了隐变如何调节突变和偏见复制的功能影响到不同的进化命运。

　　

来自加拿大拉瓦尔大学（Université Laval）多个研究机构的研究人员，包括 PROTEO - 魁北克蛋白质功能、工程与应用研究组、拉瓦尔大学大数据研究中心等，在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Cryptic genetic variation shapes the fate of gene duplicates in a protein interaction network” 的论文。该研究意义重大，首次系统地探究了隐性遗传变异在塑造旁系同源蛋白质中突变功能效应方面的作用，为理解基因复制后的进化机制提供了关键见解，有助于深入认识复杂细胞系统的演化规律，对生物学领域的发展有着重要推动作用。

在蛋白质的演化过程中，它们处于广阔的序列空间，存在着许多功能相似的蛋白质。因此，蛋白质在维持功能的同时，序列可以发生改变，这种不改变功能的序列变化被称为隐性遗传变异。尽管蛋白质在探索这一序列空间时分子功能得以保留，但其未来的进化能力可能会发生变化。隐性突变的积累会形成一种遗传背景，由于上位性，相同的突变在功能等效的蛋白质上可能会产生不同的影响。这种隐性变异和上位性决定了功能相似蛋白质中的突变是适应性的、中性的还是有害的。

许多执行相似功能的直系同源蛋白质中引入的替换可能会产生相反的效果，这证明了隐性变异对进化的影响。基因复制在生物进化中十分普遍，据估计，约 30% 保留下来的基因副本在数百万年的时间里通过维持相同功能而具有高度的功能冗余性。在基因副本保持功能冗余的过程中，它们会积累隐性分歧，这种分歧可能会影响未来突变的结果，对蛋白质的进化产生重要作用。例如，当前冗余的一对旁系同源物中的一个可能更容易因未来的突变而失去部分或全部功能，从而影响亚功能化和非功能化的发生。

研究人员以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为模型生物，选取了一对由全基因组复制事件产生的重复基因 MYO3 和 MYO5，它们编码参与内吞作用的运动蛋白（1 型肌球蛋白）。这两个基因的 C 末端 SH3 结构域在蛋白质定位和肌动蛋白聚合中起着关键作用，且在功能上具有冗余性，但表达水平和氨基酸序列存在差异，是研究冗余旁系同源物序列演化和功能变化的理想模型系统。

1. 构建突变文库：利用基于 PCR 的饱和突变方法，对 MYO3 和 MYO5 的 SH3 结构域分别构建完整的单氨基酸突变文库。通过在 pUC19 质粒上进行突变，使用包含简并核苷酸（NNN）的寡核苷酸在每个密码子处进行诱变，经过短 PCR 和长 PCR 步骤，生成突变文库质粒，再将其转化到大肠杆菌 MC1061 感受态细胞中。

2. 菌株构建与验证：在 BY4741 和 BY4742 遗传背景下构建相关菌株。对于批量竞争 DHFR - PCA 实验，构建携带不同标签和抗性标记的菌株。将突变文库通过 CRISPR - Cas9 介导的同源定向修复插入到酵母基因组的 MYO3 和 MYO5 位点，包括原生位点和交换位点，并对插入后的文库进行质量控制和验证。此外，还构建了用于验证研究的 SH3 变体菌株和携带嵌合变体的菌株。

3. 实验检测与数据分析：采用二氢叶酸还原酶蛋白片段互补测定（DHFR - PCA）结合深度测序的方法，定量检测突变对蛋白质 - 蛋白质相互作用的影响。在不同时间点收集细胞进行 Illumina 测序，通过计算突变体频率的 log2 倍变化（F）来评估突变的功能效应，并进行标准化处理得到突变的功能效应值（ΔF）。同时，对测序数据进行质量控制、比对、过滤等处理，以确保数据的准确性和可靠性。为了研究不同因素对突变功能效应的影响，还进行了多种分析，如比较不同遗传背景下突变的功能效应、确定突变的偶然性、分析突变对亚功能化和非功能化的影响等。

量化突变的功能效应

研究人员创建了 MYO3 和 MYO5 的 SH3 结构域单氨基酸突变文库，并将其插入酵母基因组的原生位点和交换位点。通过批量竞争实验，利用 DHFR - PCA 方法定量测定突变对与八个已知功能结合伙伴相互作用的影响。该实验测量结果具有高度可重复性，通过多种验证实验和计算分析证明了其可靠性。实验数据与已发表的其他 SH3 结构域功能诱变研究数据集以及折叠稳定性测量结果相关性良好，也与进化模型预测相符。

调控分歧使结合损伤产生偏差

基因复制后，许多基因副本对会随时间发生调控分歧，导致两个副本表达水平不同。在 1 型肌球蛋白中，MYO5 的蛋白表达水平略高于 MYO3，这至少部分是由于 MYO5 的启动子更强。研究人员分析了五个具有相似 log2 倍变化动态范围的相互作用，发现对于大多数相互作用伙伴，在 MYO3 位点引入的突变比在 MYO5 位点引入的相同突变导致更高的结合损失。通过进一步比较在不同位点引入 Myo3 SH3 结构域突变的功能效应，发现当控制编码序列差异时，MYO3 位点的结合损伤仍高于 MYO5 位点；而当控制调控差异时，这种位点间的功能效应偏差大多消失。这表明突变对蛋白质 - 蛋白质相互作用的损伤程度受体内表达水平影响，且这种功能效应偏差在不同相互作用伙伴间并不一致，可能与结合亲和力和蛋白质的时空丰度有关。

Myo3 SH3 结构域的多个突变破坏特定相互作用

研究人员观察 Myo3 SH3 结构域与 Bbc1 相互作用时突变的功能效应，发现某些保守残基（如 G35、W36 和 P51）对所有突变都不耐受，而其他保守位置的残基（如 Y7、F9 和 Y54）仅允许化学保守突变。通过分析突变在不同位点的平均功能效应，发现有 17 个位点的平均功能效应在不同相互作用间存在差异，其中 10 个位点与 Osh2 相互作用时的平均功能效应低于与其他四个相互作用伙伴的平均功能效应。例如，E17 位点的所有突变会强烈破坏与 Osh2 的结合，但许多突变为疏水氨基酸的突变对其他相互作用伙伴的结合没有影响。此外，研究还发现，进化过程中受到最强约束的位点会强烈破坏所有相互作用，而约束较弱的位点对 Osh2 的相互作用破坏更强，这些突变的固定可能导致旁系同源物的亚功能化。

隐性编码分歧导致突变功能效应的偶然性

研究人员分析了在两个 SH3 结构域的系统发育可变位点引入突变对与 Osh2、Bbc1 和 Pan1 相互作用的影响，以测试隐性编码分歧是否会影响氨基酸取代对相互作用的破坏作用。他们将突变引入两个 SH3 结构域并比较其功能效应，发现许多突变在不同结构域中的功能效应存在显著差异，即存在偶然性突变。对于与 Osh2 的相互作用，在相同残基位点（如 A6、G13）和不同残基位点（如 K2/M2、I25/V25）都观察到了偶然性突变，且不同位点的偶然性突变在两个结构域中的破坏程度不同。总体而言，与 Osh2、Bbc1 和 Pan1 相互作用时，分别约有 15%、10% 和 6% 的非不变位点突变是偶然性突变。此外，偶然性突变在分歧位点比在相同位点更富集，这种偶然性可能导致基因副本亚功能化的偏向性。

溶剂暴露和快速进化位点的突变在亚功能化中的偶然性富集

研究人员以与 Osh2 相互作用中确定的偶然性突变作为参考，在宽松的阈值下检查其他相互作用中的偶然性突变，发现 4.3% 的突变在非功能化效应上具有偶然性，8.7% 的突变在亚功能化效应上具有偶然性。例如，E4D 突变在 Myo3 SH3 结构域中引入时，对所有相互作用的破坏作用比在 Myo5 SH3 结构域中引入时更大，是在非功能化效应上具有偶然性的突变；K40G 突变在 Myo3 SH3 结构域中引入时，仅对与 Osh2 的相互作用破坏作用更大，是在亚功能化效应上具有偶然性的突变。进一步分析发现，溶剂暴露位点的突变在亚功能化效应上具有偶然性的比例高于埋藏位点，快速进化位点的突变在亚功能化效应上具有偶然性的比例高于缓慢进化位点；而在非功能化效应上，暴露位点和埋藏位点、快速进化位点和缓慢进化位点的突变比例没有显著差异。这表明在亚功能化过程中，突变更倾向于发生在溶剂暴露和快速进化的位点。

成对上位性足以产生偶然性

两个旁系同源的 SH3 结构域在功能上等效，但它们之间的 11 个分歧残基对隐性分歧的贡献存在两种可能：在没有上位性的情况下，每个分歧残基单独对结合偏好没有影响；在存在上位性的情况下，这些突变只有结合在一起才对结合偏好没有影响。研究人员通过将一个旁系同源物的分歧残基单独和成对引入另一个旁系同源物中，并检测其对与 Bbc1、Osh2 和 Pan1 相互作用的影响来验证这两种可能性。实验结果表明，存在上位性，许多突变的功能效应受到其他突变的影响。例如，在 Myo3 - Osh2 相互作用中，v26I 突变单独引入时会导致相互作用强烈下降，但与 a39G 或 t56K 突变结合时，相互作用下降的情况得到挽救，且 a39G 和 t56K 通过不同机制发挥作用。在 Myo3 - Bbc1 相互作用中，也观察到类似的现象，这表明成对上位性足以产生突变功能效应的偶然性，这种偶然性至少在 a39G 替换在 Myo5 SH3 结构域中固定时就已开始存在。

该研究系统地探究了隐性遗传变异对旁系同源蛋白质中突变功能效应的影响，表明复制蛋白质之间的调控分歧和隐性编码分歧能够决定哪些突变会导致基因副本的亚功能化和非功能化。调控分歧在生物中普遍存在，高表达的基因副本能够缓冲许多突变对蛋白质 - 蛋白质相互作用的影响，这为解释高表达水平如何降低依赖蛋白质 - 蛋白质相互作用形成功能复合物的蛋白质突变的适应性成本提供了可能。

蛋白质结合结构域通常与多个独立的伙伴结合，其结合偏好的进化受到强烈约束。突变对不同结合伙伴的影响存在差异，这种差异有助于理解隐性编码分歧如何导致不同相互作用中功能效应的差异。在非功能化效应中观察到的偶然性可能源于突变对一个结构域中所有蛋白质 - 蛋白质相互作用的破坏作用更强，这可能是由于破坏了共同的结合界面或降低了蛋白质稳定性导致蛋白质丰度降低；而在亚功能化效应中，偶然性源于突变对一个旁系同源物特定结合界面的破坏，且这种突变在溶剂暴露残基中富集。

随着隐性编码分歧和调控分歧在复制基因中的同时积累，它们关闭了某些进化轨迹，同时开启了其他轨迹，这种偶然性使得预测哪些突变会导致基因副本的亚功能化或非功能化变得困难。冗余持续的时间越长，隐性变异积累得越多，就越难以预测基因副本未来的进化以及更广泛的蛋白质相互作用网络的重组方式。该研究为理解基因复制后的进化过程提供了新的视角，有助于深入研究复杂细胞系统中遗传变异与蛋白质功能进化之间的关系，对生物学多个领域的研究有着重要的指导意义，为后续相关研究奠定了坚实基础。