脑型疟疾进展期间和青蒿素治疗后小鼠脑的时空转录谱分析

通过整合单细胞和空间转录组学分析，Chen等人分析了脑型疟疾期间和青蒿素治疗后小鼠大脑中的细胞破坏。

　　

中国中医科学院中药研究所青蒿素研究中心、道地药材质量保障与可持续利用国家重点实验室的研究人员 Jiayun Chen 等人，在Nature Communications期刊上发表了题为 “The spatiotemporal transcriptional profiling of murine brain during cerebral malaria progression and after artemisinin treatment” 的论文。该研究通过构建实验性脑型疟疾（ECM）小鼠脑的单细胞和空间转录组图谱，揭示了疟原虫感染和青蒿素治疗后脑内细胞和分子的变化机制，为理解疟原虫 - 宿主相互作用机制和辅助治疗开发提供了有价值的资源，对脑型疟疾的研究和治疗具有重要意义。

研究背景

脑型疟疾（CM）是由疟原虫感染引起的严重脑病，每年导致数千人死亡，即便经过抗疟药物治疗，患者仍可能出现神经认知后遗症。目前，抗疟药物无法有效控制 CM 死亡率，也难以预防患者出现长期神经认知问题，这主要归因于对其病因了解有限、治疗途径不佳以及治疗复杂性。

在 CM 发病机制中，寄生虫在脑血管内的滞留、血脑屏障（BBB）损伤、病理性免疫反应和神经元功能障碍是主要特征。受感染的红细胞（iRBC）在脑血管内积累和滞留，通过疟原虫红细胞膜蛋白 - 1（PfEMP - 1）与内皮细胞上的多种配体相互作用，导致内皮细胞激活、血管通透性增加和 BBB 破坏。同时，患者对疟原虫感染的先天性和适应性免疫反应与内皮功能障碍和 BBB 破坏同时发生，免疫细胞在脑微血管中的积累也参与了 CM 的发病过程，但免疫细胞在疾病发展和药物治疗后的动态变化及空间分布尚不明确。

青蒿素及其衍生物是一线抗疟药物，虽能有效杀死疟原虫，但患者接受治疗后仍存在神经认知障碍，目前对这种持续损伤的分子和细胞机制了解有限。此外，以往研究使用的微阵列和批量 RNA - seq 技术分辨率有限，难以识别关键细胞亚群及其在 ECM 发展过程中的细胞反应，且不同脑区各种细胞类型的空间表达模式及细胞间通讯也有待揭示。

研究材料方法与技术路线

研究人员选用 C57BL/6 J 野生型雄性小鼠构建 ECM 模型，将小鼠随机分为对照组（CON）、ECM 模型组和青蒿琥酯（ART）治疗组。ECM 模型组和 ART 治疗组小鼠腹腔注射感染伯氏疟原虫 ANKA（PbA）的红细胞，ART 治疗组小鼠在感染后第 5 天开始腹腔注射青蒿琥酯（10mg/kg），持续 3 天，对照组注射生理盐水。实验过程中监测小鼠体重、疟原虫血症、生存状况和快速小鼠昏迷行为量表（RMCBS）评分。

实验运用了多种技术方法：通过苏木精 - 伊红（H&E）染色、伊文思蓝（EB）染色、免疫荧光染色（IF）、免疫组化染色（IHC）、多重免疫组化染色（mIHC）、蛋白质免疫印迹法（WB）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等实验，对小鼠脑组织的病理特征、蛋白表达和细胞因子浓度等进行检测；利用 10x Genomics scRNA - seq 技术对小鼠脑组织进行单细胞转录组分析，确定细胞类型和基因表达谱；基于 10x Genomics Visium 进行空间转录组测序（ST - seq）分析，探究基因表达的空间分布，并整合公共 ST - seq 数据集作为对照；开发寄生虫 - 宿主分析流程，识别感染的红细胞（iRBC）；运用多种生物信息学分析方法，如差异表达基因（DEGs）分析、基因本体（GO）富集分析、空间轨迹推断分析、拟时间分析和细胞 - 细胞通讯分析等，深入挖掘数据信息。

技术路线方面，先构建 ECM 模型并进行 ART 治疗，获取小鼠脑组织样本。接着对样本进行单细胞和空间转录组测序，得到原始数据后进行质量控制和数据处理。然后，利用多种生物信息学工具和方法对处理后的数据进行分析，识别细胞类型、研究基因表达变化、细胞间通讯以及空间分布特征等。最后，结合实验结果和分析结论，深入探讨 ECM 的发病机制以及 ART 治疗的效果和影响。

研究结果

ECM 模型的建立及 ART 治疗效果

与对照组相比，ECM 组小鼠在感染后约 5 天出现症状，包括体重急剧下降、疟原虫血症和死亡率大幅上升、RMCBS 评分降低。感染第 8 天，ECM 组小鼠 BBB 完整性受损，紧密连接蛋白表达下调，大脑皮层和海马区出现 iRBC 滞留、血管周围间隙扩大和血管渗漏等典型病理特征，血清中潜在神经损伤标志物浓度升高。ART 治疗虽能缓解部分症状，但小鼠的 RMCBS 评分、BBB 完整性、病理特征以及神经损伤标志物浓度仍未恢复到健康基线水平，表明 ECM 小鼠在 ART 治疗后仍存在神经和认知缺陷。此结论通过对小鼠体重、疟原虫血症、RMCBS 评分等指标监测，以及对 BBB 完整性、病理特征和血清标志物检测得出。

ECM 小鼠脑的单细胞转录组分析

研究人员利用 10x Genomics scRNA - seq 技术对 CON、ECM 和 ART 组小鼠脑组织进行检测，共分离并测序 85,734 个细胞，经质量控制后保留 77,296 个细胞。这些细胞被整合、归一化处理后进行主成分分析（PCA）降维，划分出 50 个独特的细胞簇，进一步分类为 17 种主要细胞类型。通过差异表达基因分析和 GO 富集分析，确定了与各细胞类型高度相关的生物学过程。同时发现，ECM 和 ART 组中 T 淋巴细胞 / NK 细胞、单核细胞和中性粒细胞的比例相较于 CON 组增加，表明 PbA 感染小鼠脑组织中存在外周免疫细胞的募集和浸润。这一结论基于对大量细胞的测序、分类以及基因表达分析得出。

ECM 小鼠脑的空间转录组分析

对 ECM 和 ART 组小鼠脑组织进行 ST - seq 分析，并整合 4 个健康小鼠脑的公共 ST - seq 数据集作为对照。通过多种方法对 ST - seq 数据集中的斑点进行注释，确定了包括神经元、少突胶质细胞等在内的 7 种主要斑点类型。研究发现，免疫和内皮斑点在 ECM 样本中主要分布于中脑和皮层后端的界面区域，免疫细胞在皮层区域弥散分布并在免疫斑点处富集，部分免疫斑点与内皮斑点共定位，表明免疫细胞在 ECM 发展过程中向脑微血管募集并与内皮细胞相互作用。此外，ECM 组免疫斑点的相对比例高于其他两组，六重免疫组化染色也显示 ECM 和 ART 组部分区域 T 细胞和髓细胞的丰度和空间浸润增加。这些结论通过对 ST - seq 数据的分析、斑点注释以及免疫组化染色等实验得出。

scRNA - seq 数据集中感染红细胞的转录组分析

研究人员开发寄生虫 - 宿主分析流程，在小鼠红细胞中识别出 iRBC。以 1% 的 PbA 基因表达百分比作为感染阈值，共鉴定出 919 个健康红细胞（hRBC）和 14 个 iRBC。研究发现，iRBC 中一些与疟原虫相关的基因表达增强，且与 hRBC 相比，iRBC 中某些与 MHC - I 结合的 T 细胞表位基因表达上调。对 iRBC 和 hRBC 进行 DEGs 分析，发现 PbA 上调基因主要与热休克蛋白、核糖体蛋白等相关，基于 Mm10 的 DEGs 的 GO 富集分析揭示了 iRBC 中整合素激活上调，氧化磷酸化和 ATP 代谢过程下调。这些结论通过自主开发的分析流程以及基因表达分析得出。

ECM 发展过程中炎症性内皮细胞激活并介导 BBB 损伤

从整合的 scRNA - seq 数据集中提取 24,770 个 BBB 相关细胞，重新定义为 13 个亚型。其中，炎症性内皮细胞在 ECM 组中的比例从 CON 组的 0.26% 急剧增加到 17.74%，ART 治疗后降至 2.91%，免疫荧光实验验证了这一比例变化。ECM 组中，炎症性内皮细胞以及部分动脉和静脉内皮细胞的黏附分子和炎症细胞因子表达增强。空间分布上，炎症性内皮细胞在 ECM 样本的内皮斑点中富集，且其分布与 BBB 破坏、抗原呈递和白细胞黏附相关。通过对不同组内皮细胞的分析、免疫荧光和免疫组化实验以及空间轨迹推断分析得出此结论。

ECM 期间及 ART 治疗后炎症性小胶质细胞增强抗原呈递

从 scRNA - seq 数据集中提取髓样细胞并重新聚类为 12 个亚型，发现炎症性小胶质细胞、非经典单核细胞和活化中性粒细胞在 ECM 组中的比例显著增加，且 ART 治疗后未缓解，免疫荧光实验验证了炎症性小胶质细胞的比例变化。炎症性小胶质细胞在 ECM 组中炎症因子和趋化因子表达较高。对炎症性小胶质细胞进行 DEGs 分析，发现 ECM 和 ART 组中均有与肽抗原结合和 CD8 受体结合相关的基因上调。在 ST - seq 数据集中，ECM 和 ART 组免疫斑点的抗原加工和呈递模块得分高于 CON 组，且在 ECM 样本中观察到炎症性小胶质细胞相关基因的空间共定位。这些结论通过对髓样细胞的聚类分析、基因表达分析、免疫荧光实验以及对 ST - seq 数据的分析得出。

PbA 感染后 CD8 + 细胞毒性 T 细胞募集到脑组织并激活

研究发现 ECM 和 ART 组中淋巴细胞数量显著增加，基于关键标记物的表达将淋巴细胞分为 9 个亚型，其中 CD8 + T 细胞（包括多种亚型）在 PbA 感染后比例显著增加，ART 治疗后有所下降，CD8 + 细胞毒性 T 细胞亚型比例变化趋势与之相似，免疫荧光实验验证了这一结果。通过拟时间分析发现，CD8 + 细胞毒性 T 细胞在 ECM 发病过程中发生炎症状态转变，细胞因子表达和细胞毒性活性上调，同时验证了相关蛋白的表达变化，且在 ST - seq 数据集中观察到 ECM 组 T 细胞迁移和细胞毒性相关通路得分增强，ART 治疗后部分缓解。这些结论通过对淋巴细胞的分类、比例分析、拟时间分析、蛋白表达验证以及对 ST - seq 数据的分析得出。

ECM 和 ART 小鼠中 MHC - I 相互作用途径的激活

利用 scRNA - seq 和 ST - seq 数据集分析细胞间通讯，发现 ECM 和 ART 组中 T 淋巴细胞 / NK 细胞与其他细胞类型的相互作用数量多于 CON 组，免疫斑点的相互作用也增加。在多个细胞间通讯途径中，MHC - I 和 ITGAL - ITGB2 途径在 ECM 和 ART 组中均被激活，免疫组化实验验证了 MHC - I 表达上调。进一步分析发现，ECM 和 ART 组中一些与 MHC - I 相关的配体 - 受体对的相互作用强度增强，且在特定区域观察到炎症性内皮细胞、炎症性小胶质细胞和 CD8 + 细胞毒性 T 细胞的共定位，免疫荧光实验验证了 CD8 + T 细胞与小胶质细胞和内皮细胞的相互作用。这些结论通过对细胞间通讯的分析、免疫组化和免疫荧光实验得出。

大脑矢状面神经元斑点的持续干扰素反应

在 ST - seq 数据集中，根据小鼠大脑参考图谱将大脑矢状面分为十个区域，提取神经元斑点并分为 10 个区域亚型。对不同区域的神经元斑点进行 DEGs 分析，发现 ECM 组中多个区域的神经元斑点免疫相关基因上调，基于这些 DEGs 的 GO 富集分析表明，干扰素 - γ 反应、白细胞迁移等免疫相关途径在 ECM 和 ART 组中显著上调，且 ART 治疗后这些炎症途径仍持续激活。进一步分析发现，ECM 和 ART 组神经元斑点的 IFN - γ 反应模块得分高于 CON 组，且嗅球区域的神经元斑点 IFN - γ 反应模块得分最高。在 scRNA - seq 数据集中，对神经元细胞进行分析，发现成熟兴奋性神经元和成熟抑制性神经元在 ECM 和 ART 组中 IFN - γ 反应模块得分相对较高，且 ECM 样本中的神经元斑点主要由这两种亚型组成。这些结论通过对 ST - seq 和 scRNA - seq 数据集中神经元相关数据的分析得出。

研究结论与讨论

该研究运用 scRNA - seq 和 ST - seq 技术，全面探究了 PbA 感染和 ART 治疗后 ECM 小鼠脑的细胞组成和空间分布，确定了与 ECM 相关的基质和免疫亚群，描绘了细胞通讯网络，揭示了大脑矢状面神经元的基因特征，并观察到神经元中干扰素反应在 ECM 期间和 ART 治疗后的持续激活。

研究揭示了 CM 发病机制中一些关键细胞和分子机制。在 iRBC 与内皮细胞相互作用方面，虽然 ECM 模型中 iRBC 与人类脑型疟疾（HCM）中 iRBC 的滞留机制不同，但研究 iRBC 基因和途径有助于理解其在 ECM 发展过程中的作用。炎症性内皮细胞在 ECM 脑内数量增加且被免疫细胞包围，其抗原呈递、白细胞黏附与 BBB 破坏相关，可能通过 CD8 + T 细胞等进一步加重脑部病变。研究还鉴定出具有特定功能的经典单核细胞、中性粒细胞和炎症性小胶质细胞亚型，它们在 ECM 发病过程中分别通过释放炎症因子、激活相关途径和呈递抗原等方式发挥重要作用。此外，CD8 + T 细胞在 ECM 发展中至关重要，靶向该细胞的治疗方法展现出治疗潜力；神经元在 PbA 感染过程中，其免疫相关途径激活，尤其是 IFN - γ 反应，可能导致神经元损伤，且 ART 治疗后炎症状态未完全恢复，这与患者治疗后神经认知障碍的持续存在相关。

研究也指出了当前研究的局限性。ECM 小鼠模型与 HCM 存在差异，研究结果外推至人类需谨慎验证；研究仅聚焦于小鼠脑矢状面，未来应从更多时间点、空间维度和更高分辨率进行研究；scRNA - seq 数据集中捕获的神经元细胞数量较少，后续可采用单细胞核 RNA 测序等技术深入研究；还需进一步开展实验和临床研究，评估和比较 ART 与免疫调节辅助治疗的联合疗效。

总体而言，该研究强调了宿主免疫反应在 CM 发展中的关键作用，为理解 CM 发病机制提供了新视角，表明基于调节宿主免疫反应的辅助治疗有望提高抗疟疗效并减少并发症，为脑型疟疾的治疗和研究提供了重要的理论依据和研究方向。