编辑推荐：
为探究拟南芥中 DNA 去甲基化酶的调控机制及 H3K4me3 与 DNA 甲基化的关系，相关研究人员开展研究。结果发现 H3K4me3 可擦除 DNA 甲基化、促进基因激活。该成果有助于理解植物表观遗传，为开发表观基因组工程工具提供思路，值得一读。
在植物的奇妙世界里，基因的表达调控就像一场精密的交响乐演奏，而 DNA 甲基化（一种在 DNA 分子上添加甲基基团的修饰方式，它能影响基因的表达）则是其中一位重要的 “指挥家”。DNA 甲基化在植物基因组中起着关键作用，通常与基因沉默紧密相连，就像是给基因加上了一把锁，让它们暂时 “安静” 下来。而且，植物中 DNA 甲基化模式可以稳定地在世代间遗传，许多具有重要表型（比如植物的开花时间、株高等外在特征）的表观遗传等位基因，虽然 DNA 序列相同，但甲基化状态和表达状态却不一样。
植物的 DNA 甲基化是如何建立和维持的呢？原来，它是由 RNA 指导的 DNA 甲基化（RdDM）途径在所有序列环境（CG、CHG（H = A、T、C）和 CHH）中建立起来，并由不同的 DNA 甲基转移酶系统负责维持。在这些序列环境中，CG 序列环境中的 DNA 甲基化对于维持基因沉默尤为关键。不过，DNA 甲基化也不是一成不变的，它可以通过两种方式发生变化。一种是被动的，当 DNA 甲基转移酶无法正常发挥功能时，DNA 甲基化会在复制过程中逐渐丢失；另一种则是主动的，植物体内有一种特殊的糖苷酶家族，包括 REPRESSOR OF SILENCING 1（ROS1）、DEMETER（DME）、DEMETER - LIKE 2（DML2）和 DML3，它们能主动去除 DNA 上的甲基基团，让基因重新 “活跃” 起来。
与 DNA 甲基化相对的，是植物中活跃染色质（染色质是细胞内遗传物质的载体，活跃染色质区域的基因更容易表达）位点与各种正性表观遗传标记相关，其中就有 H3K4 的三甲基化（H3K4me3）。在拟南芥中，有许多组蛋白甲基转移酶控制着 H3K4 位点的甲基化，SET DOMAIN PROTEIN 2（SDG2）是负责添加 H3K4me3 的主要酶之一。而 H3K4 甲基化的去除则由 H3K4 去甲基化酶来完成，像 Jumonji 结构域包含蛋白 JMJ14 - 18、LYSINE SPECIFIC DEMETHYLASE LIKE（LDL1 - 3）和 FLOWERING LOCUS D（FLD）等都参与其中。
之前的研究发现，把细菌的 CG 特异性 DNA 甲基转移酶 Sss1/MQ1 靶向拟南芥的 FLOWERING WAGENINGEN（FWA）基因时，会导致 DNA 甲基化和基因沉默的发生。而且，高表达 SssI 的拟南芥植株在整个基因组中会出现广泛的异位 CG DNA 甲基化。但奇怪的是，许多基因组区域，尤其是含有正性表观遗传标记（如组蛋白乙酰化和 H3K4me3）的蛋白质编码基因启动子区域，却很难建立 DNA 甲基化。这就像在坚固的城堡前，DNA 甲基化这支部队难以攻破城门一样。这些现象让科学家们猜测，是不是某些正性表观遗传标记在积极抵抗 DNA 甲基化呢？为了弄清楚这个问题，来自相关研究团队的科研人员在《Nature Plants》期刊上发表了题为 “Targeted H3K4me3 erases DNA methylation and promotes gene activation in Arabidopsis” 的论文。他们通过一系列实验，得出了令人瞩目的结论：H3K4me3 是一种强大的抗 DNA 甲基化标记，它可以通过招募 DNA 去甲基化酶，主动擦除 DNA 甲基化，促进基因激活。这一发现不仅加深了我们对植物表观遗传途径的理解，还为开发更强大的表观基因组工程工具奠定了基础，就像为科学家们打开了一扇通往植物基因奥秘的新大门。
在这项研究中，科研人员运用了多种技术方法。他们利用染色质免疫沉淀测序（ChIP - seq，一种可以研究蛋白质与 DNA 相互作用的技术），来检测 H3K4me3、ROS1 等蛋白在基因组上的结合位点；通过全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS，能分析全基因组 DNA 甲基化水平的技术）和重亚硫酸盐 PCR 测序（BS - PCR - seq，针对特定区域检测 DNA 甲基化水平的技术），精确测定 DNA 甲基化水平；借助 RNA 测序（RNA - seq，用于分析基因表达水平的技术），了解基因的表达变化情况。这些技术就像科研人员手中的 “魔法棒”，帮助他们一步步揭开植物基因调控的神秘面纱。
下面我们来详细看看他们的研究结果。
靶向 SDG2 催化结构域可擦除 CG DNA 甲基化
之前的研究发现 H3K4me3 和 CG DNA 甲基化之间存在反相关关系，这让科研人员想要直接验证建立 H3K4me3 是否会对抗 CG 甲基化。SDG2 是拟南芥中主要的 H3K4me3 甲基转移酶，科研人员将 SDG2 的催化结构域（SDG2cd）与人工锌指 ZF108 融合（SDG2cd - ZF），并让其靶向拟南芥的 FWA 基因。FWA 基因是一个很有价值的内源性报告基因，在野生型 Col - 0 背景下，它的启动子区域由于密集的 CG DNA 甲基化而沉默，就像被封印了一样。而在 fwa 表观等位基因中，这些 DNA 甲基化丢失，FWA 基因就会过度表达，导致植物出现晚花的表型，就好像植物的生长节奏被打乱了。
当科研人员把由 UBQ10 启动子驱动的 SDG2cd - ZF 转化到野生型植株中后，发现许多转基因株系出现了晚花表型，同时 FWA 基因表达被激活，DNA 甲基化几乎完全被去除。而且，FWA 基因的激活、DNA 甲基化的去除以及晚花表型在不同转基因株系中的变化，都与 SDG2cd - ZF 的蛋白质表达水平密切相关。为了进一步确认 H3K4me3 的沉积和 DNA 甲基化的去除依赖于 SDG2 的催化活性，科研人员还构建了 H1866K 错义突变版本的 SDG2cd - ZF。结果发现，这个突变完全阻断了 H3K4me3 的沉积和 FWA 位点的 DNA 甲基化去除，这就像是给 SDG2 的 “工作机器” 按下了停止键。
科研人员还把 SDG2cd 克隆到基于 dCas9 的 SunTag 系统（SunTag - SDG2cd）中，并让其靶向 FWA 启动子。一开始，在 Col - 0 背景下，虽然它能激活一些 FWA 基因的表达并去除部分 DNA 甲基化，但却没有诱导出晚花表型。后来，科研人员发现将其转化到 rrd6 背景（这个背景能减少转基因沉默）中，dCas9 的表达明显增加，SunTag - SDG2cd 对 FWA 基因的激活和 DNA 甲基化的去除效果也大大提高，一些 T2 代植株甚至出现了中间晚花表型。这些结果都表明，H3K4me3 靶向能够对抗 DNA 甲基化，就像给基因的 “沉默枷锁” 找到了一把钥匙。
SDG2cd - ZF 介导的 DNA 去甲基化作用广泛存在于不同区域
已知 ZF108 不仅能结合 FWA 基因，还能结合拟南芥基因组中数千个脱靶位点。这就给科研人员提供了一个很好的机会，去研究靶向 H3K4me3 在其他位点的作用。通过分析 ChIP - seq 数据，科研人员发现 SDG2cd - ZF 植物中，在大多数具有强烈 ZF ChIP - seq 峰的 6091 个位点上，都有大量的 H3K4me3 积累。
接着，科研人员利用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）比较了 SDG2cd - ZF 和野生型植物的甲基化谱，发现 H3K4me3 水平与这些 ZF 脱靶位点的 DNA 甲基化水平呈负相关，尤其是 CG 甲基化。在 SDG2cd - ZF 植物中，大多数 ZF 结合位点（5212 个，占 6091 个的 85%）的 H3K4me3 水平增加，其中 1287 个在 Col - 0 中已有 DNA 甲基化的 ZF 结合位点，约 65%（834 个）在 SDG2cd - ZF 中 DNA 甲基化水平降低。这表明诱导的 H3K4me3 在整个基因组中广泛对抗 CG 甲基化。
在拟南芥中，大约三分之一的基因在转录区域含有 CG 甲基化（基因体甲基化）。当 ZF 峰与基因体甲基化区域对应时，SDG2cd - ZF 引入的 H3K4me3 峰对应的焦点区域会出现一致的甲基化丢失。而且，科研人员还偶尔观察到从 H3K4me3 峰起始的异位基因内转录延伸到正常转录区域的 3' 端，但也有很多基因表达没有变化的情况。这说明 H3K4me3 并不总是足以驱动基因表达，而且表达变化不太可能是导致 DNA 甲基化丢失的原因。当 ZF 峰对应转座子或 DNA 甲基化的基因间区域时，H3K4me3 峰与 CG、CHG 和 CHH DNA 甲基化的去除相关，并且通常（但不总是）与表达增加相关。这些数据表明，H3K4me3 和 DNA 甲基化之间的对抗作用不仅发生在正常的转录起始位点，还发生在基因组的许多其他位点，包括基因体 CG DNA 甲基化位点和转座子。这就像是 H3K4me3 在基因组的各个角落与 DNA 甲基化展开了一场 “战斗”，守护着基因的表达平衡。
H3K4me3 靶向招募 DNA 去甲基化酶
H3K4me3 的增加是如何导致 CG DNA 甲基化丢失的呢？科研人员对此展开了深入研究。从理论上讲，这种丢失可能是由于 CG 甲基化维持失败，也可能是由 DNA 去甲基化酶主动去除 DNA 甲基化导致的。在成年拟南芥组织中，表达三种 DNA 去甲基化酶：ROS1、DML2 和 DML3。
为了验证这些去甲基化酶是否与 H3K4me3 介导的 CG 甲基化丢失有关，科研人员将 SDG2cd - ZF 转化到 ros1 - 3 dml2 - 1 dml3 - 1（rdd）三重突变体中。结果发现，在这个背景下，40 个 SDG2cd - ZF T1 代株系中没有一个在 FWA 位点显示出 DNA 甲基化减少，这表明去甲基化酶的存在是甲基化丢失所必需的。科研人员还通过蛋白质免疫印迹分析排除了是因为 rdd 突变体背景下的高甲基化导致 SDG2cd - ZF 转基因沉默的可能性。
之前的研究表明，组蛋白乙酰转移酶 IDM1 在 ROS1 靶向的部分位点的 DNA 去甲基化中起作用。科研人员将 SDG2cd - ZF 引入 idm1 突变体背景中，发现 idm1 突变体并不能阻断 FWA 位点的 DNA 甲基化去除，这说明 IDM1 对于 SDG2cd - ZF 转基因株系中 FWA 位点的 DNA 去甲基化不是必需的。这些结果都表明，在 FWA 和其他基因组位点上靶向 H3K4me3 会通过 ROS1/DML2/DML3 去甲基化酶的主动去除作用导致 DNA 去甲基化。
科研人员还发现，尽管在 rdd 突变体中 SDG2cd - ZF 不能去除 DNA 甲基化，但仍然能够诱导一些 FWA 基因的激活，不过激活水平比野生型背景低很多。在 ZF 脱靶位点也是如此，SDG2cd - ZF 在没有 DNA 去甲基化的情况下，仍然能够在少数基因体甲基化的蛋白质编码基因中诱导基因间转录，以及诱导一些甲基化转座子的表达。这表明 H3K4me3 在 FWA 和其他位点的沉积可以通过两种不同的机制刺激转录，一种依赖于 DNA 甲基化的去除，另一种则不依赖。
为了进一步验证 DNA 去甲基化酶参与了 SDG2cd - ZF 诱导的 DNA 甲基化丢失，科研人员将 Myc - ROS1 转化到 SDG2cd - ZF 转基因株系中，并进行 Myc ChIP - seq。结果观察到 ROS1 信号在 FWA 以及 ZF 脱靶位点有强烈的富集，这表明 H3K4me3 的沉积招募了 ROS1 来启动 DNA 去甲基化。而且，科研人员还发现 ROS1 峰比 H3K4me3 峰更宽，这可能解释了为什么 DNA 甲基化减少的区域往往比相应的 H3K4me3 富集区域更宽。此外，在 SDG2cd - ZF 转基因株系中，H2A.Z 和 H3K14ac 在 FWA 和 ZF 脱靶位点也有强烈的富集，这表明 SDG2cd - ZF 介导的 H3K4me3 沉积促进了 H3K14ac、H2A.Z 和 ROS1 的靶向，以及 DNA 的去甲基化，说明 H3K4me3 招募了一系列与主动 DNA 去甲基化相关的活动。
科研人员还对野生型植物进行了 Myc - ROS1 ChIP - seq，发现 ROS1 在基因转录起始位点附近的 H3K4me3 峰处有强烈的富集，并且 ROS1 与其他基因相邻位点（对应 DNA 甲基化和 RdDM 因子 Pol V 的位点）部分重叠。这表明 ROS1 也被招募到这些位点，在那里对抗 DNA 甲基化。而且，ROS1 ChIP - seq 信号在转录起始位点处，在基因表达水平和 H3K4me3 水平较高的基因上更高。这些结果表明，ROS1 招募到启动子中的 H3K4me3 位点可能通常用于保护基因免受异常高甲基化的影响，而 SDG2cd - ZF 介导的 DNA 去甲基化酶的招募可能利用了这个自然途径。
去除 H3K4me3 促进靶向 DNA 甲基化
由于 H3K4me3 和 DNA 甲基化之间存在对抗关系，科研人员推测靶向 H3K4me3 去甲基化可能会促进在基因启动子序列中更有效地建立 DNA 甲基化。他们在寻找能够有效靶向 H3K4me3 去甲基化的蛋白质时，发现了一种小的卷曲螺旋结构域蛋白 At4g35510，将其命名为 TRB INTERACTING PROTEIN1（TRBIP1）。当 TRBIP1 与 ZF 融合并引入未甲基化的 fwa 表观等位基因背景中时，它能非常有效地沉默 FWA 基因，使植物出现早花表型。
H3K4me3 ChIP - seq 证实，TRBIP1 - ZF 能非常有效地去除 H3K4me3，比之前观察到的 JMJ14 - ZF 或 TRB - ZFs 效果更好。BS - PCR - seq 分析表明，TRBIP1 - ZF 不会在 FWA 启动子区域建立 DNA 甲基化。而且，Myc ChIP - seq 显示 JMJ14 在 Myc - JMJ14×TRBIP1 - ZF 株系中被强烈招募到 FWA 和 ZF 脱靶位点。这些结果表明，TRBIP1 - ZF 能够有效靶向基因沉默、招募 JMJ14 并去除 H3K4me3。
为了测试强制去除 H3K4me3 是否能提高靶向 DNA 甲基化的效率，科研人员将靶向 CG 特异性 SssI/MQ1 细菌甲基转移酶与 TRBIP1 结合。之前研究发现，当将具有改进特异性的 MQ1 氨基酸变体（MQ1v）与 dCas9 融合时，它在 FWA 位点介导的 DNA 甲基化和沉默效率较低。科研人员创建了 TRBIP1 - dCas9 - MQ1v，并与原来的 dCas9 - MQ1v 进行比较。结果发现，添加 TRBIP1 后，DNA 甲基化显著增加，H3K4me3 减少，FWA 基因被强烈沉默，植物出现早花表型，并且排除了是由于蛋白质表达水平差异导致的这种结果。这表明去除 H3K4me3 可以增强 DNA 甲基化的沉积。
这项研究表明，靶向拟南芥基因组特定区域的 H3K4me3 会导致这些位点的 DNA 去甲基化，这种去甲基化依赖于 ROS1 类 DNA 去甲基化酶。H3K4me3 的靶向与 ROS1 的招募、组蛋白变体 H2A.Z 和组蛋白乙酰化相关。在基因组的大多数位置，H3K4me3 靶向导致的 DNA 甲基化丢失与转录增加无关，说明 DNA 甲基化的丢失不是转录刺激的间接效应。而且，研究还发现 H3K4me3 是一种强大的抗 DNA 甲基化标记，参与塑造整个基因组的甲基化模式。
虽然 ROS1 类去甲基化酶是植物特有的，但拟南芥中 H3K4me3 和 DNA 甲基化之间的对抗关系与哺乳动物甲基化系统有相似之处。在哺乳动物中，从头 DNA 甲基化因子 Dnmt3L 会被招募到未甲基化的 H3K4 位点，并被 H3K4me3 排斥。这说明 H3K4me3 在多种真核生物系统中都作为一种抗 DNA 甲基化标记，尽管其机制可能非常不同。
对 H3K4me3 和 DNA 甲基化之间对抗关系的理解，有助于开发更复杂的工具来操纵植物基因组中的 DNA 甲基化模式。研究人员通过实验证明，将 H3K4me3 去除因子与 DNA 甲基转移酶结合，可以在拟南芥中更有效地建立 DNA 甲基化。靶向基因组甲基化可以用于调节基因表达，为植物研究和农业生物技术创造新的表观等位基因。这项研究的成果就像给植物基因研究和农业发展注入了新的活力，为未来的植物基因工程提供了重要的理论基础和实践指导，让我们能够更好地利用植物基因的奥秘，培育出更优良的植物品种，为农业生产和生态保护带来更多的可能。
