鸡肉产品中多药耐药肠炎沙门氏菌明尼苏达血清克隆的基因组调查

　　

沙特鸡肉制品中耐多药明尼苏达沙门氏菌克隆株的基因组调查研究解读

来自阿卜杜拉国王科技大学（King Abdullah University of Science and Technology, KAUST）传染病流行病学实验室等多个单位的研究人员，在npj Antimicrobials & Resistance期刊上发表了题为 “Genomic survey of multidrug resistant Salmonella enterica serovar Minnesota clones in chicken products” 的论文。该研究对沙特鸡肉制品中的明尼苏达沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Minnesota，S. Minnesota）进行了基因组监测，在了解该菌的种群基因组学、防控食源性疾病以及保障公共卫生安全等方面具有重要意义。

一、研究背景

非伤寒沙门氏菌（Non - typhoidal Salmonella，NTS）是主要的食源性细菌病原体，每年在全球范围内引发大量肠胃炎病例和众多死亡案例，尤其在资源有限地区和免疫功能低下人群中，其引发的侵袭性感染危害严重。而且，NTS 的耐药问题日益严峻，耐药性可通过多种途径传播，给疾病防控带来极大挑战。

明尼苏达沙门氏菌作为一种新兴的 NTS 血清型，近年来在禽类养殖及相关食品中的流行率不断上升。自 2003 年巴西针对肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）引入疫苗后，明尼苏达沙门氏菌的流行率随之上升，这可能与疫苗使用和动物中广泛使用抗菌药物有关。同时，巴西作为禽类主要出口国，明尼苏达沙门氏菌借助食品出口链在全球传播。然而，目前对该菌的致病机制了解有限，虽然有一些病例报道，但由于其分离频率低，相关研究较少。此前虽有研究利用全基因组测序探索其多样性和遗传特征，但样本量有限，难以全面掌握其种群动态和耐药克隆的区域流行病学情况。沙特阿拉伯的家禽产业规模庞大，鸡肉消费量大，且存在大量家禽进出口活动，沙门氏菌感染在当地也是常见的细菌传染病，每年有较多病例报告。因此，在沙特开展明尼苏达沙门氏菌的大规模基因组监测研究十分必要。

二、研究材料与方法

（一）样本采集与分离

2020 - 2022 年，沙特食品药品管理局（SFDA）微生物参考实验室从鸡肉产品样本中收集了 859 株沙门氏菌，其中 259 株被鉴定为明尼苏达沙门氏菌。这些菌株部分来自沙特国内超市的家禽样本，部分来自巴西进口的家禽产品，还有 1 株来自沙特吉达医院收治的沙门氏菌病患者。样本采集遵循世界卫生组织指南，分离和初步鉴定按照 ISO 6579 - 1:2017/Amd 1:2020 标准进行，后续通过多种检测方法进行确认，确认后的菌株保存于生物样本库。

（二）抗菌药敏试验

采用微量肉汤稀释法，使用 Sensititre EUVSEC3 检测板对所有明尼苏达沙门氏菌分离株进行抗菌药敏试验，该检测板包含 15 种不同类别的抗菌药物。试验过程遵循制造商指南，以大肠杆菌 ATCC 25922 作为质量控制参考菌株，依据不同标准解读最低抑菌浓度（MICs）。

（三）DNA 提取与测序

使用 DNeasy PowerSoil 试剂盒提取基因组 DNA，评估纯度和浓度后，利用 Nextera XT DNA 样本制备试剂盒和索引试剂盒构建文库，经纯化、归一化和混合后，在 Illumina NovaSeq 6000 平台上进行 250 bp 双端测序。此外，还对部分样本进行了第三代长读长测序，以获取完整质粒片段。

（四）数据分析

运用多种软件对短读长测序数据进行质量控制、组装、基因检测、耐药表型关联分析、系统发育分析等。同时，通过获取全球公共数据库中的基因组数据，进行聚类分析和构建最小生成树，以了解菌株的种群结构。利用 BEAST 软件进行系统发育动力学分析，推断克隆的进化参数和传播历史。基于 SNP 距离和分离日期，使用 R 包 adegenet 重建潜在的近期传播网络。对长读长测序数据进行混合组装，注释和分析质粒，包括聚类、基因检测和可视化等，并通过多种统计检验评估数据差异的显著性。

三、研究结果

（一）S. Minnesota 种群结构显示多个克隆的出现

分析 259 株沙特来源的 S. Minnesota 分离株全基因组测序数据，并结合全球 507 株菌株数据，通过 BAPS 聚类分析发现 14 个克隆（BAPS 组）。多数克隆包含来自不同来源的菌株，不同大陆的菌株在主要克隆中分布不均。沙特和巴西的分离株在多个克隆中共存，且包含沙特分离株的克隆遗传多样性较低、样本更新。从系统发育树可知，包含沙特分离株的克隆起源于较老的 BAPS6 克隆，研究中的人类感染分离株与食品分离株在 BAPS2 克隆中聚类，提示可能的食物污染传播途径。

（二）近期克隆在国家和全球层面同时出现并扩张

对沙特的 BAPS1 - 4 克隆进行分析，发现它们在 5 - 7.5 年内同时形成，替换率与鼠伤寒沙门氏菌相近。所有克隆形成后种群呈增长趋势，其中 BAPS2 克隆扩张迅速。系统发育动力学树显示 BAPS2 和 BAPS4 克隆在 2010 - 2014 年形成，BAPS2 克隆中巴西样本是沙特克隆及其他国家克隆的祖先，BAPS4 克隆中巴西和葡萄牙的谱系分别产生了沙特的不同分支，表明这些克隆在全球和区域的传播情况。

（三）S. Minnesota 分离株的全球和本地传播

通过构建传播网络，在 BAPS1 - 4 克隆中分别鉴定出不同数量的传播子网。多数子网包含来自不同城市或国家的分离株，BAPS1 克隆中同一城市不同供应商的菌株存在混合，BAPS3 和 BAPS4 克隆中有国际间菌株传播的网络，BAPS4 克隆中巴西分离株可能通过进口事件成为沙特分离株的祖先，验证了该菌在食物链中本地和全球同时传播的模式。

（四）近期 S. Minnesota 克隆中抗菌耐药和毒力基因的流行增加

与较老的克隆相比，包含沙特和巴西样本的 BAPS1 - 6 克隆携带显著更多的 AMR 和毒力因子基因，表明这些近期克隆的毒力和耐药水平增强。

（五）抗菌耐药基因的多样性和基因组背景

研究鉴定出多种耐药基因，其在不同克隆中的分布存在差异。部分耐药基因位于质粒上，如 ESBL 基因blaCTX - M 存在于多种质粒背景中。虽然耐药基因多样，但只有部分与耐药表型显著相关，如氨基糖苷类的aac3和aph4基因、β - 内酰胺类的blaCMY - 2 基因、大环内酯类的erm和mphA基因等。

（六）S. Minnesota 克隆中毒力因子基因的多样性

S. Minnesota 基因组包含 213 种不同的毒力基因，其中 88 种在辅助基因组中。37 种毒力基因在克隆间分布不同，包括编码 III 型分泌系统（T3SS）的基因和铁载体基因簇等。不同克隆具有独特的铁载体基因组合，BAPS1 - 6 克隆因携带特定铁载体基因，毒力基因含量更高。

（七）S. Minnesota 分离株含有携带抗菌耐药基因的多种质粒

鉴定出 39 个质粒片段，分为 4 个簇。不同簇的质粒在不同克隆中的分布不同，如 Cluster 2 和 Cluster 1 中的质粒在近期 BAPS1 - 6 克隆中更常见，Cluster 3 中的 AMR 相关质粒在 BAPS1 - 4 克隆中低频存在，可能导致新的高耐药克隆出现。

（八）IncC 质粒的基因组结构显示其为携带耐药和毒力基因的镶嵌质粒

Cluster 4 中的 IncC 质粒具有镶嵌结构，包含耐药和毒力基因，对近期克隆的高耐药和毒力水平有贡献。长读长测序揭示其最大质粒含有毒力岛，耐药基因分散在质粒骨架上，且该质粒可能具有部分接合能力。

（九）IncC 质粒骨架上耐药基因的基因组重排

IncC 质粒在不同分离株中耐药基因的配置多样，基因存在可变现象。BAPS1 - 5 克隆中含有耐药基因的区域发生重排，部分质粒甚至丢失耐药基因。基因水平的比对显示质粒骨架因耐药基因的移动发生重排，有时会导致毒力岛倒置，这表明质粒的结构变化和重组与克隆扩张同时发生。

四、研究结论与讨论

研究人员通过对沙特家禽链中 S. Minnesota 的基因组分析，揭示了其种群结构和多样性。过去 10 年出现了具有本地和全球分布的新克隆，其区域和全球扩张与沙特家禽肉的进出口和国内生产模式相符，全球家禽肉生产和贸易链促进了该菌的传播。研究还发现新克隆中存在多种 AMR 基因和毒力基因，其多样性源于水平基因转移和抗菌药物使用的选择压力。IncC 质粒在 S. Minnesota 克隆的近期进化中起关键作用，其重排可能是细菌应对抗菌治疗的适应性机制，可能推动新的高耐药和高毒力克隆的出现。

然而，该研究存在一定局限性。样本多为耐多药菌株，无法评估耐药菌株选择对新克隆出现的影响程度；人源样本稀缺，难以全面了解动物菌株对人类健康的影响。未来研究可扩大样本范围，纳入敏感菌株，并采用 “同一健康” 方法，综合研究人、食品和动物中的分离株，以更全面地了解 S. Minnesota 的多样性、毒力和生存能力，为有效治疗、管理和预防人类和动物疾病提供关键信息。

这项研究首次在沙特大规模开展 S. Minnesota 的基因组监测，为深入了解该菌的进化、传播和耐药机制提供了重要依据，有助于制定针对性的防控策略，保障公共卫生安全，对全球家禽产业和食品安全领域也具有重要的参考价值。