提升黏膜疫苗效力

　　

新型佐剂 CVP：提升黏膜疫苗效力的新希望

近日，来自日本国立传染病研究所药物和疫苗开发研究中心的 Eita Sasaki 等人在npj Vaccines期刊上发表了题为 “Calboxyvinyl polymer adjuvant enhances respiratory iga responses through mucosal and systemic administration” 的研究论文。该研究发现羧基乙烯基聚合物（CVP）作为一种新型佐剂，在提升黏膜疫苗免疫反应方面展现出巨大潜力，这一成果为疫苗研发领域开辟了新的方向，有望解决现有疫苗佐剂的诸多问题，推动更安全、有效的黏膜疫苗的开发。

一、研究背景

疫苗接种是控制病原体传播的有效策略，对于流感病毒和冠状病毒等呼吸道病毒，黏膜疫苗策略尤为有利。鼻腔疫苗能将抗原直接递送至呼吸道病毒附着和感染的起始部位 —— 上呼吸道和鼻腔，诱导产生的 IgA 抗体可有效阻断病毒感染，且 IgA 抗体对某些抗原的中和能力比 IgG 抗体更强，对不同病毒株具有高交叉反应性。然而，目前季节性流感疫苗主要通过皮下或肌肉注射给药，虽能预防严重感染，但无法防止初始感染，对意外出现的病毒株效果有限，在老年人中效果也欠佳。已获批的鼻腔减毒活流感疫苗（Flumist）虽能增强黏膜和全身免疫反应，但不适用于免疫功能低下的个体，且需要冷藏运输，在发展中国家应用受限。

佐剂可增强疫苗免疫原性，但现有佐剂存在诸多问题。例如，最广泛使用的铝佐剂是不溶性颗粒，不适合鼻腔给药；靶向模式识别受体（PRR）的佐剂，如 poly I:C、R848 和 CpG K3 等，虽能诱导 Th1 免疫，但 Th2 免疫对 IgA 产生也很重要，且这些佐剂可能引发炎症，导致局部和全身副作用，部分在小鼠中表现良好的 PRR 激动剂在人体中会引起严重副作用。因此，开发更安全有效的鼻腔疫苗佐剂迫在眉睫。

二、研究材料与方法

（一）材料

研究使用了多种抗原和佐剂，包括流感病毒裂解疫苗（SV）、全颗粒疫苗（WPV）、SARS-CoV-2 刺突蛋白 S1 抗原和刺突三聚体蛋白等抗原，以及铝佐剂（alum）、AddaVax、poly I:C、R848、CpG K3 等现有佐剂和 CVP、非交联 CVP（Ncl-CVP）、高粘度 CVP（HV-CVP）等实验用佐剂。实验动物选用 6 - 7 周龄雌性 BALB/c 小鼠和柬埔寨食蟹猴，同时使用了来自健康成人的外周血单个核细胞（PBMC）和多种细胞系。

（二）方法

1. 筛选佐剂候选物：通过构建基于肺生物标志物基因表达谱的体内筛选系统，将 17 种药物基质材料经鼻腔给予小鼠，16 小时后收集肺部组织分析生物标志物基因表达水平，以预测和评估候选物的佐剂活性和毒性。

2. 评估佐剂活性和物理特性：将含有不同药物基质材料的疫苗经鼻腔接种小鼠，21 天后收集支气管肺泡灌洗液（BALF），检测疫苗抗原特异性 IgA 抗体产生水平；同时分析药物基质材料的粘度和 pH 值，探究其与 IgA 抗体诱导能力的相关性。

3. 验证 CVP 的佐剂活性：分别用含 CVP、Ncl-CVP 或不含佐剂的疫苗经鼻腔接种小鼠，分析生物标志物基因表达水平和免疫原性；还通过皮下接种疫苗，检测 CVP 对血清中抗原特异性 IgG 抗体滴度的影响。

4. 评估 CVP 的安全性：经鼻腔给予小鼠不同浓度的 CVP、现有佐剂或 WPV，分析体重变化、白细胞计数、血清 IgE 抗体水平、发热反应、肺组织病理变化和细胞因子分泌等指标，评估 CVP 的安全性。

5. 动物感染实验：用 CVP 佐剂的流感疫苗和 SARS-CoV-2 疫苗分别对小鼠进行免疫，然后用相应病毒感染小鼠，监测体重变化、病毒滴度等指标，评估疫苗的保护效果；对食蟹猴进行免疫原性测试，检测抗体滴度、中和活性和细胞因子产生等。

6. 其他实验方法：运用 ELISPOT 测定小鼠 IFNγ 产生细胞数量，通过体内杀伤试验评估细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）活性，采用流式细胞术分析细胞亚群和细胞内细胞因子，使用 ELISA 测定抗体浓度，通过伪病毒中和试验评估血清的病毒中和活性等。

三、研究结果

（一）从药物基质材料中探索佐剂候选物

利用基于肺生物标志物基因表达谱的筛选系统，对 17 种药物基质材料进行筛选。发现编号为 #1 - 8 的药物基质材料能显著提高 Timp1、Cxcl11 和 Cxcl9 的表达，提示其具有黏膜佐剂活性；生物标志物基因表达谱分析表明，#1 - 8 号材料通过增加 IgA 抗体产生发挥佐剂作用，且其作用模式与已知的 DAMP 诱导型佐剂相似。

（二）评估药物基质材料的佐剂活性和物理特性

在含不同药物基质材料的疫苗中，#1 - 8 号材料显著提高了疫苗抗原特异性 IgA 抗体产生水平，且优于部分现有佐剂。然而，药物基质材料的粘度和 pH 值与 IgA 抗体诱导能力无相关性，表明 #1 - 8 号材料的佐剂活性独立于其粘度。

（三）药物基质材料佐剂活性由 CVP 诱导

CVP 存在于 #1 - 8 号药物基质材料中，实验表明 Ncl-CVP 不能诱导 Timp1、Cxcl9 或 Cxcl11 表达，也几乎不增强抗原特异性 IgA 抗体产生；而 CVP 能显著增加这些基因的表达和 IgA 抗体产生，且 IgA 产生水平高于现有佐剂。此外，即使皮下接种疫苗，CVP 也能显著提高血清中抗原特异性 IgG 抗体滴度，说明 CVP 在黏膜疫苗和注射疫苗中均具有强佐剂活性。

（四）CVP 佐剂的流感疫苗在小鼠中激活 CTL

通过 ELISPOT 和体内杀伤试验评估 CVP 佐剂诱导疫苗特异性 CTL 的能力。结果显示，肌肉接种 CVP 和 poly I:C 的小鼠中，IFNγ 产生细胞增加；体内杀伤试验表明，肌肉接种 CVP 的小鼠 CTL 活性最高，鼻腔接种 CVP 的小鼠 CTL 活性与 poly I:C 相当，且 CVP 可能通过 IFNγ 非依赖途径诱导鼻腔疫苗的 CTL 反应。此外，CVP 能增强 CD11b+CD103+ DCs 的 MHC I 类抗原呈递，有助于 CTL 的诱导。

（五）CVP 作为低细胞因子诱导特性的安全佐剂

在安全性评估实验中，CVP 经鼻腔接种未导致小鼠体重显著下降和白细胞减少，虽能增强以 OVA 为抗原时的血清 IgE 抗体产生，但在流感疫苗有效抗原剂量下未诱导 IgE 抗体产生，且未显著增加总血清 IgE 水平。在兔子实验中，CVP 未诱导发热反应；在小鼠和人 PBMC 实验中，CVP 未诱导明显的细胞因子或趋化因子产生，且其佐剂活性不依赖于 I 型干扰素信号，也不直接激活 PRR 信号通路。

（六）单剂量接种 CVP 佐剂的流感疫苗可抵御致死性流感病毒感染

在致死性流感病毒感染模型中，单剂量接种 0.3% CVP 佐剂的 SV 疫苗的小鼠未出现体重减轻，且体重显著增加；0.03% CVP 佐剂的 SV 疫苗接种小鼠体重恢复更快。CVP 佐剂组的 BALF 和鼻腔灌洗液中的流感病毒滴度低于其他组，表明单剂量接种 CVP 佐剂的 SV 疫苗比部分现有佐剂联合 SV 疫苗具有更高的保护效果。

（七）CVP 对重组 SARS-CoV-2 S1 蛋白疫苗的佐剂活性

以重组 SARS-CoV-2 S1 蛋白为抗原，研究 CVP 在鼻腔 SARS-CoV-2 疫苗中的作用。结果显示，CVP 佐剂的鼻腔疫苗诱导的 IgA 滴度最高，肌肉接种 CVP 佐剂疫苗也能暂时提高 BALF 和鼻腔灌洗液中的 IgA 滴度。在小鼠感染实验中，CVP 佐剂的鼻腔疫苗显著预防了 SARS-CoV-2 感染导致的体重减轻，并降低了病毒 RNA 水平。此外，CVP 佐剂疫苗对 SARS-CoV-2 变异株具有一定的交叉保护作用，能增强 B 细胞成熟，促进抗原特异性抗体产生。

（八）CVP 佐剂的 SARS-CoV-2 疫苗在食蟹猴中的强免疫原性

对食蟹猴进行免疫原性测试，发现 CVP 佐剂的 SARS-CoV-2 疫苗能显著提高鼻腔灌洗液中的 IgA 抗体滴度和血清中的 IgG 抗体滴度，且具有高病毒中和活性。肌肉接种 CVP 佐剂疫苗也能诱导鼻腔 IgA 抗体产生。细胞因子分析表明，鼻腔接种疫苗可增加 BALF 中 IL-5 产生细胞，肌肉接种可增加血液中 IFNγ 产生细胞。同时，鼻腔接种 CVP 佐剂疫苗不太可能引起细胞因子风暴或发热，而肌肉接种可能导致轻微发热。

四、研究结论与讨论

本研究成功从药物基质材料中筛选出具有强大佐剂活性的 CVP。CVP 作为一种已用于滴鼻剂的安全赋形剂，在鼻腔疫苗中展现出卓越的 IgA 抗体诱导能力和 CTL 激活活性，能有效抵御流感和 SARS-CoV-2 感染。其佐剂活性具有低 IFN 和细胞因子依赖性，作用机制独特。与现有佐剂相比，CVP 安全性更高，即使接触肺部也不会诱导慢性炎症或强细胞毒性。

然而，该研究也存在一定局限性。例如，小鼠鼻腔接种疫苗的体积较大，可能导致疫苗佐剂到达肺部和支气管，与人类鼻腔疫苗的实际情况不同；实验主要分析了肺部细胞和 BALF 中的抗体产生和免疫细胞，未来应使用更低剂量的鼻腔接种进行研究，以更好地模拟人类鼻腔疫苗的情况。此外，CVP 虽在兔子实验中未诱导发热，但在食蟹猴肌肉接种实验中导致发热，提示其与抗原联合肌肉接种可能诱导发热，这一现象的具体机制有待进一步研究。

总体而言，CVP 作为一种极具潜力的鼻腔疫苗佐剂，有望加速疫苗的临床应用。其安全性和有效性为疫苗研发提供了新的方向，未来对 CVP 佐剂机制的深入研究，将有助于开发出更高效、更安全的黏膜疫苗，在预防呼吸道病毒感染和控制疫情传播方面发挥重要作用。