揭秘顺乌头酸脱羧酶：pH 与缓冲液如何左右其底物结合与催化？

为探究缓冲液和 pH 对顺乌头酸脱羧酶（ACOD1）酶动力学的影响，研究人员开展相关研究。结果发现高浓度磷酸盐抑制该酶，还确定了适宜缓冲液及酶动力学在不同 pH 下的变化。这为优化 ACOD1 检测及设计相关研究提供重要依据。

　　在生命的微观世界里，细胞的代谢活动时刻都在有条不紊地进行着，其中顺乌头酸脱羧酶（cis - Aconitate decarboxylase，ACOD1）扮演着重要角色。ACOD1 能在激活的髓系细胞（如巨噬细胞）中催化合成衣康酸，而衣康酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化、细胞保护和免疫调节等多种功能。在肿瘤研究领域，ACOD1 的作用备受关注，其在肿瘤组织中的表达与多种癌症的不良临床预后相关，它会降低肿瘤微环境中 CD8⁺ T 细胞的抗肿瘤活性，还可能对癌细胞产生直接的促肿瘤作用，因此 ACOD1 成为肿瘤学中新兴的治疗靶点，寻找有效的 ACOD1 抑制剂迫在眉睫。

此前研究虽已对 ACOD1 的晶体结构和体外活性检测方法有所探索，但仍存在诸多未知。比如，pH 对 ACOD1 底物结合和催化速率的影响尚未明确，特定缓冲液对酶活性的潜在作用也未被探究。要知道，缓冲液分子可能与酶相互作用，pH 的变化也会通过影响酶、底物或辅因子关键基团的质子化状态来改变酶活性，这些因素对于深入了解 ACOD1 的作用机制以及开发精准的抑制剂至关重要。

为了解开这些谜团，德国亥姆霍兹感染研究中心（Helmholtz Centre for Infection Research）等机构的研究人员开展了一项深入研究。他们发现高浓度的磷酸盐会抑制人、小鼠 ACOD1 以及土曲霉 CAD（Aspergillus terreus CAD）的活性，还筛选出了更适宜的缓冲液，并优化了检测方法。同时，研究人员测定了不同 pH 条件下酶的动力学参数，发现 pH 在 7.5 - 8.25 之间时，ACOD1 的 K_M值显著增加，这表明活性位点中多个组氨酸残基的质子化状态对底物结合至关重要。该研究成果发表在《Scientific Reports》上，为 ACOD1 相关研究开辟了新的方向，有助于更深入地理解 ACOD1 的作用机制，也为开发更有效的 ACOD1 抑制剂提供了关键依据，有望推动肿瘤治疗领域的发展。

研究人员在开展研究时，运用了多种关键技术方法。首先是蛋白质表达与纯化技术，通过大肠杆菌表达并纯化人 ACOD1、小鼠 ACOD1 和土曲霉 CAD 蛋白。其次是酶活性检测技术，在 96 孔板中进行酶反应，利用高效液相色谱（HPLC）测定衣康酸产量，从而确定酶的动力学参数。此外，还运用了细胞培养技术，培养人髓单核细胞白血病细胞系 THP1 并诱导其分化为巨噬细胞，以测定细胞内顺乌头酸的浓度。

研究结果

1. 缓冲液对酶活性的影响：研究人员对比了不同缓冲液对酶活性的影响。在以往的 ACOD1 检测中，常用 200 mM 的磷酸钠缓冲液。此次研究发现，在 pH 6.5、7.0 和 7.5 时，167 mM 的磷酸盐会强烈竞争性抑制人、小鼠和土曲霉的 ACOD1 酶活性。进一步研究发现，添加 100 mM NaCl 使不同缓冲液离子强度相似后，使用 50 mM MOPS、HEPES 或 Bis - Tris 缓冲液（含 100 mM NaCl，pH 7.5）时，三种酶的 K_M和 k_cat基本不受缓冲液种类影响。最终选择 50 mM MOPS 缓冲液（含 100 mM NaCl）用于后续实验。
2. pH 对酶动力学的影响：利用优化后的检测方法，研究人员测定了人 ACOD1（hACOD1）、小鼠 ACOD1（mACOD1）和土曲霉 CAD（aCAD）在 pH 5.5 - 8.25 范围内的米氏常数（K_M）和催化速率常数（k_cat）。结果显示，hACOD1 和 mACOD1 的 k_cat在 pH 5.5 - 8.0 基本不变，aCAD 在 pH 6.5 - 7.0 的微酸性范围内 k_cat最高。对于所有三种酶，K_M值在 pH 7.0 - 8.25 之间大幅增加，增长倍数达 20 倍以上。
3. 活性位点组氨酸残基的作用：通过对 K_M的 pH 依赖性进行分析，研究人员发现，当 pH > 7.5 时，曲线斜率达到 - 2，这表明至少有两个 pK_a值低于 7.5 的残基（推测为组氨酸）需要质子化才能实现底物结合。对人 ACOD1 中组氨酸残基的突变研究发现，His159Ala 突变体仍有酶活性，但 K_M和 k_cat均受损，且其 pK_M - pH 曲线与野生型相似，这意味着突变体底物结合需要剩余的 His103 和 His277 质子化。
4. 生理相关性研究：为探究上述 K_M值的生理相关性，研究人员测定了人巨噬细胞（以 THP1 细胞分化而来）中的顺乌头酸浓度。结果显示，未刺激时顺乌头酸浓度为 16 μM（0.38 pmol/μg 细胞蛋白），刺激后略有降低。在 pH 7.0、底物浓度为 12 μM 时，hACOD1 的催化活性仅为最大值的 5%，但线粒体附近顺乌头酸浓度升高可提高其活性。

研究结论与讨论

该研究揭示了高浓度磷酸盐对 ACOD1 和 CAD 酶的抑制作用，以及缓冲液和 pH 对酶动力学的重要影响。确定了至少两个活性位点组氨酸残基需要质子化才能结合底物，且底物结合依赖于质子化组氨酸与底物羧基之间的静电相互作用。研究还发现，ACOD1 在碱性 pH 条件下 K_M值的变化意味着其在细胞内不同 pH 环境中的活性存在差异，这对于理解 ACOD1 在不同亚细胞区室中的功能具有重要意义。此外，优化后的缓冲液和检测方法能更准确地模拟生理条件，有助于筛选更有效的 ACOD1 抑制剂，为肿瘤治疗研究提供了更可靠的实验依据。这些研究成果不仅加深了人们对 ACOD1 作用机制的理解，还为相关疾病的治疗和药物研发提供了新的思路和方向。