综述：高级别胶质瘤中单细胞和空间转录组特征的综合视角

　　

高级别胶质瘤单细胞和空间转录组特征的综合视角

塞莉亚?勒穆瓦纳、马克 - 安托万?达?维加、贝尔纳?罗吉斯特、卡罗琳?皮埃特、维吉妮?内林克斯

高级别胶质瘤（HGG）是儿童和成人中无法治愈的脑恶性肿瘤。转录组技术的突破性进展揭示了 HGGs 中细胞状态的复杂多样性及其空间组织形式。比利时列日大学吉加研究所神经系统疾病与治疗实验室的研究人员对 17 项基于单细胞和空间 RNA 测序的研究中描述的 55 种肿瘤转录组特征进行了定性整合。本综述描绘了一系列由特定基因表达所代表的细胞状态，这些状态可沿着 “反应 - 发育程序” 轴进行概念化理解。此外，研究人员还讨论了影响这些细胞状态的潜在因素，包括空间组织如何影响转录组动态变化。利用这些有深刻见解的发现，研究人员探讨了一种新颖的、不断发展的方式，将不同的转录组特征在二维或三维空间中进行整合，纳入发育状态、增殖能力以及向反应状态转变的可能性。这种综合分析揭示了 HGGs 多样的细胞景观，为进一步阐明恶性机制和设计治疗方案提供了宝贵资源。

高级别胶质瘤（HGGs）是侵袭性很强的恶性肿瘤，在成人和儿童中预后都很差。2016 年和 2021 年，世界卫生组织的分类有了很大发展，对成人型和儿童型 HGGs 进行了完整的组织分子分层，分为两类（图 1）。最具侵袭性的成人型 HGGs 被归类为 4 级异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变型星形细胞瘤和 IDH 野生型（WT）胶质母细胞瘤（GBM），后者是成人中最常见的原发性脑肿瘤。诊断时的中位年龄分别为 57 岁和 68 岁。尽管标准治疗方案包括最大限度的手术切除，随后进行放疗并辅以同步和辅助化疗，但 4 级 IDH 突变型星形细胞瘤的中位生存期仅为 25 个月，GBM 为 10 个月。相比之下，儿童型 HGGs 包含四种分子定义的亚型：弥漫性中线胶质瘤（DMG）H3 K27 改变（组蛋白 H3F3A 或 HIST1H3B 基因中的 K27M 突变）；弥漫性半球胶质瘤，H3 G34 突变（H3F3A 基因中的 G34R/V 突变）；弥漫性儿童型 HGG，H3-WT 和 IDH-WT；以及婴儿型半球胶质瘤。对于这些最近定义的亚型，精确的流行病学数据很少。在一项对儿童型 HGGs 的综合分子荟萃分析中，报告了 DMG H3.3K27M 的中位总生存期为 11 个月，DMG H3.1K27M 为 15 个月，H3 G34 突变型为 18 个月，H3-WT 和 IDH-WT 为 17.2 个月。目前，治疗策略包括在可行的情况下进行手术切除，然后根据分子亚型进行放疗，可选择是否使用替莫唑胺辅助治疗。

成人型和儿童型 HGGs 的一个特征是复杂的异质性，这给治疗带来了阻碍。肿瘤异质性源于构成肿瘤微环境（TME）的肿瘤细胞和非肿瘤细胞的共存。肿瘤细胞本身在遗传学、表观遗传学和转录组学方面也存在不同程度的异质性。在本综述中，研究人员选择专注于转录组学研究，由于 RNA 测序（RNA-seq）等最新技术的发展，转录组学在过去十年有了特别的进展。在患者间层面，开创性研究突出了多种 HGG 亚型，其中最著名的是 Verhaak 等人提出的 “间充质”“经典 ” 和 “前神经 ” 亚组。几年后发现，这些研究只是触及了 HGG 深层复杂性的表面，HGG 转录组学已朝着单细胞分辨率发展。单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）揭示了与肿瘤内不同细胞类型、功能和状态相关的特定基因表达特征。最近，空间转录组学进一步实现了对与空间信息相关的 RNA 含量的分析，强调了特定的生态位及其独特的基因表达模式。这些关键分析产生了大量数据，付出了诸多努力，共同增进了对 HGGs 高度异质性的理解，为更有针对性的治疗铺平了道路。然而，作为单独的研究，它们在 HGG 诊断、管理和治疗中的实际应用仍有待验证。

鉴于转录组学在 HGGs 中的关键作用，研究人员旨在提供一篇综述，整合近期关于 HGGs 肿瘤内肿瘤转录组异质性的研究，以强化个体观察结果，并为神经肿瘤学领域的科学家提供对近期文献的深入见解。研究人员将单细胞和空间 RNA 测序分析中描述的众多基于转录组的癌性 HGG 细胞状态及其相关基因，沿着 “反应 - 发育程序” 轴进行定性排列，以便一目了然地提供清晰概述。为了全面呈现脑部发生的高度侵袭性恶性肿瘤的情况，研究人员对比了分子特征不同的成人型 HGGs（称为 H3 WT 或未确定（H3 WT/ND））与儿童型 DMG H3 K27 改变（H3K27M）和弥漫性半球胶质瘤 H3 G34 突变（H3G34R/V），以报告它们的异同。研究人员还讨论了细胞状态动态变化背后的一些内部和外部因素、对 HGG 空间组织的新见解以及临床前景。除了综述工作，研究人员还提出了关于细胞状态演变的新观点。

方法

研究选择标准

研究人员选择了 17 项探讨 HGG 异质性的 scRNA-seq 和空间 RNA-seq 研究，这些研究是在 2014 年 Patel 等人的开创性论文发表之后发表的。每篇入选论文都提出了成人型和 / 或儿童型 HGGs 中肿瘤细胞的新颖、原创的基因表达特征（补充表 1）。本综述未考虑肿瘤微环境细胞的转录组特征。

基因表达特征的比对

在大多数入选研究中，作者将新出现的肿瘤转录组特征与先前描述的特征进行对比，以突出相似之处或差异。基于这些明确的相关性，研究人员定性整合并排列了 51 种细胞状态，这些状态分布在一个颜色面板上，涵盖两个主要 “程序”（反应性和发育性），并整合了三个主要 “细胞类型 ” 类别（间充质、星形胶质和前神经），这与 Richards 和 Verhaak 的分类高度一致（图 2）。

基因列表的比较

研究人员还试图清晰概述不同细胞状态表达的最具代表性的基因。研究人员列出了原始文章热图中每个亚组突出显示的基因（图 2）。此外，研究人员收集了 H3 WT/ND 肿瘤和 H3K27M 肿瘤（如有可用数据）分别描述的不同特征相关的完整基因列表（补充表 2）。使用生物信息学和进化基因组学的维恩图工具（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）对这些基因列表进行比较。基于三个主要 “细胞类型” 类别（间充质、星形胶质和前神经），保留至少在同一类别的三个列表中都存在且不同时出现在间充质和前神经类别中的基因。研究人员进一步对细胞状态进行分组，以最好地体现所选研究中描述的特征多样性。对于 H3 WT/ND 肿瘤，间充质特征分为 “缺氧 ” 和 “免疫 ” 两组。星形胶质特征仍作为一组。对于 H3 WT/ND 肿瘤，前神经特征分为 “神经祖细胞（NPC）” 和 “少突胶质祖细胞（OPC）” 组，对于 H3K27M 肿瘤，分为 “OPC” 和 “少突胶质细胞（OC）” 组。对于每个保留的基因，计算其在每个亚组包含的列表中的阳性列表百分比，并在热图中显示（图 3，补充表 3 和 4）。需要注意的是，这些基因列表来自不同的方法学途径。不同的组织来源和采样、测序技术以及生物信息学分析（补充表 1）最终可能会得出不同的基因集。比较的目的不是建立新的特征，而是突出不同研究小组在技术差异之外描述的相似特征中重叠的基因，因为这些基因可能恰当地构成细胞状态的代表性和系统性标记。

所选 HGG 基因表达特征的综合视图

通过对 HGG 组织的多项 scRNA-seq 分析，鉴定出了反应性和间充质特征，这与之前在肿瘤间层面描述的情况一致。这些特征显示在提议的 “反应 - 发育程序” 轴的左侧（图 2：红色面板）。此外，scRNA-seq 揭示了类似于发育中大脑不同阶段的转录组特征。这些特征描绘在轴的右侧（图 2：蓝色面板）。在以下部分，研究人员讨论了特征之间的相似性，包括基因的重叠，以及在应对复杂 HGG 生物学的全局视角中整合这些特征的相关性。

反应程序 - 间充质特征、缺氧和免疫反应

在 H3 WT/ND HGGs 中，Wang Q. 等人描述了一种单细胞转录组亚型，称为 “间充质”，让人联想到 Verhaak 等人的整体分类。该亚型与 BCL3、TGFB1、ITGB1、LOX、COL1A2、VDR、IL6 和 MMP7 的表达相关。不久之后，两项研究描述了一个类似的轴，不同的 GBM 细胞状态沿着该轴从反应性程序分布到发育性程序。Wang L. 等人的反应性簇与 CD44 和 CHI3L1 的表达相关，也被称为 “间充质 ”，与先前描述的亚型相同。它过表达缺氧和炎症相关基因，如 HIF1a、CSF1、CCL2 和 CXCL2。同样，Richards 等人描述的 “损伤反应 ” 程序与间充质、炎症和免疫相关基因的高表达相关，如 CD44、ANXA2、TXN、S100A11、TAGLN2 和 TNFRSF12A。

其他研究区分了两个反应性子组。Patel 等人描述了一个 “缺氧” 元特征和一个 “补体 / 免疫反应 ” 元特征。2019 年，Neftel 等人描述了两个间充质元模块，名为 “Mes-like 1” 和 “Mes-like 2”，两者都表达被认为是间充质样的基因，如 VIM。“Mes-like 2” 模块还与缺氧相关基因如 HILPDA 和 ADM 相关，以及与应激和糖酵解相关基因如 DDIT3、ENO2 和 LDHA 相关。相比之下，“Mes-like 1” 特征与缺氧无关，与 ANXA1、ANXA2 和 CD44 的表达相关。后来，“Mes-like” 亚型与上皮 - 间充质转化、缺氧反应和干扰素 - γ 反应相关，证实了反应状态与缺氧或炎症之间的关系。2020 年，Couturier 等人也描述了两个可与这些反应程序相比较的组：与缺氧反应基因（HSPA1B、DNAJB1 和 HSP6A）相关的 “缺氧 ” 组和与 VIM、HLA-A 和 APOE 高表达相关的 “间充质 ” 组。与这些仅基于基因表达对 GBM 细胞进行聚类的研究相比，Garofano 等人基于通路对癌细胞进行聚类。他们突出了一个 “糖酵解 / 多代谢 ” 特征，与间充质转化、免疫反应和缺氧相关，并且与其他间充质特征密切相关，表明反应程序中对糖酵解途径的偏好。此外，他们的特征与脂质、氨基酸、类固醇、铁和硫代谢相关。

最近，空间转录组学为具有不同基因表达谱的细胞的空间分布提供了新见解。与先前研究一致，Ravi 等人在 H3 WT/ND HGGs 中揭示了两种空间上不同的转录组特征，名为 “反应性缺氧” 和 “反应性免疫 ”。Ren 等人对 H3K27M DMG 和 H3 WT/ND HGG 患者进行了另一项空间转录组学研究。他们描述了一个主要的反应性子组，名为 “缺氧生态位 ”，与缺氧和应激反应相关基因相关（补充表 2），以及另一个空间特征，名为 “血管生态位 ”，与血管生成和内皮细胞相关。该组更难分类，但部分与 Ravi 等人的 “反应性缺氧 ” 和 “反应性免疫 ” 亚组相关。

Greenwald 等人进一步将间充质 / 反应状态细分为三个亚组：与缺氧特征（VEGFA、NDRG1 和 PGK1）相关的 “MES - 缺氧”，与 EFEMP1、CHI3L1 和 CD44 表达相关的 “MES”，以及与胶质瘤肿瘤微管相关基因（GAP43、KCNF1 和 PTN）相关的 “MES - Ast”（星形胶质样间充质）。同样，他们研究小组的另一项整合不同 scRNA-seq 数据集的研究也表明，存在几个与缺氧和糖酵解相关的间充质子组，与星形胶质细胞和免疫相关，最后还有中间状态，这表明反应状态与微环境之间存在很强的关联，并且可能从一种反应状态转变为另一种反应状态。

使用增强型电单分子荧光原位杂交技术，Mossi Albiach 等人观察到与 Neftel 等人的 “Mes-like” 特征相关的反应状态。值得注意的是，他们对常用的 “间充质 ” 术语提出了质疑，更倾向于使用 “胶质伤口样 ” 这一术语，该术语能更好地反映胶质瘤细胞中的伤口愈合激活和缺氧反应。相比之下，他们发现了一个罕见的 “成纤维细胞样 ” 恶性细胞亚组，表达成纤维细胞标记物，如 I 型胶原蛋白（COL1A1、COL1A2）和 III 型胶原蛋白（COL3A1、DCN 和 LUM），他们认为这本身就是一种间充质状态。

总之，在大多数 H3 WT/ND HGG 肿瘤中都鉴定出了反应程序，并且可以根据缺氧和炎症 / 免疫反应进一步细分，少数研究还提出了一系列中间状态。图 3 显示了与主要不同程序相关的基因。例如，缺氧反应和糖酵解基因，如 NDRG1、PGK1、LDHA、ADM、HILPDA 和 VEGFA，是在缺氧特征中常见的代表性基因，而 CD44、FTL、CHI3L1、VIM 和 ANXA2 等基因似乎通常与反应性特征相关。

相比之下，反应程序在儿童 HGGs 中很少见。2018 年，Filbin 等人对 H3K27M HGGs 进行的开创性 scRNA-seq 研究并未发现反应状态。然而，几年后，对他们数据集的重新分析突出了所谓的间充质状态的存在。这些状态大多与星形胶质和免疫特征相关，而不是与缺氧反应相关。同时，Liu 等人对大量成人和儿童 H3K27M DMG 患者进行了 scRNA-seq，揭示了一组具有 “Mes-like” 特征的恶性细胞，与 VIM、GAP43 和 SPP1 的表达相关。与年幼的儿童相比，该程序在成年患者中更为丰富。此外，Jessa 等人在大量 H3K27M DMG 队列中发现了一个 “M6” 编码模块，该模块部分与缺氧相关。值得注意的是，上述 Ren 等人的 “缺氧生态位 ” 特征在 H3K27M HGGs 中也有突出显示。一些代表性基因在 H3 WT/ND 和 H3K27M HGGs 中是共有的，如 SLC2A3、ADM、PGK1、CD44、VIM 和 SPARCL1（图 3）。

Liu 等人最近在 H3G34R/V HGGs 中描述了一个与 ANXA1、CLU 和 CD44 表达相关的 “Mes-like” 程序。据描述，“Mes-like” 细胞的比例在患者之间差异很大，在一些肿瘤中未检测到这些细胞，这可能解释了不同研究之间的差异。

总之，反应性细胞状态在 H3 WT/ND HGGs 中似乎比在 H3K27M 和 H3G34R/V HGGs 中更丰富，并且大多与免疫和缺氧反应相关，具体情况因样本类型和方法而异。这些细胞状态的多样性、它们对多种外部影响的依赖性以及它们的实际起源仍有待理清。

发育程序 - 星形胶质、少突胶质和神经样特征

在 HGGs 中也描述了与星形胶质、神经元和少突胶质命运相关的发育特征。它们显示在 “反应 - 发育程序” 轴的中右侧（图 2：紫色到蓝色面板），与 Richards 等人提出的 “发育样 ” 程序对齐，与 “损伤反应 ” 程序相反。“发育样 ” 程序与神经发生和胶质发生相关基因的表达相关，如 PTPRZ1、ASCL1 和 SOX2，这在 Wang L. 等人表达 ASCL1 和 OLIG2 的 “前神经 ” 程序中也得到了证实。进一步的研究描绘了与星形胶质、神经元和少突胶质命运相关的更详细的发育特征。

星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元是胚胎大脑发育过程中产生的主要细胞类型。它们起源于专门的、静止的神经干细胞，称为放射状胶质（RG）细胞，RG 细胞分裂产生谱系受限的祖细胞，包括 NPCs 和 OPCs，这些祖细胞通过不同的分化步骤最终产生成熟的神经元和神经胶质细胞。

星形胶质和放射状胶质特征

在 H3 WT/ND HGGs 中，Neftel 等人鉴定出一个名为 “星形胶质细胞（AC）样” 的亚组，表达星形胶质标记物，如 GFAP、S100B 和 MLC1，Couturier 等人描述了一个 “星形胶质 ” 组，主要与星形 - 间充质基因相关，如 GFAP、VIM 和 CD44。有趣的是，VIM 和 CD44 在反应性特征中也常见表达（图 3），这表明星形胶质样细胞可能表现出一些反应性特征。尽管存在一些小差异，但这两个亚组都与 Wang Q. 等人先前描述的 “经典 ” 组密切相关，该组与 PTPRA、ELOVL2、SOX9、PAX6、DH4、SEPT