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为探究铁死亡在慢性肾脏病（CKD）中的作用机制，同济医学院研究人员开展相关研究，发现抑制肾小管上皮细胞（TECs）铁死亡可缓解肾纤维化，为 CKD 治疗提供新策略。
慢性肾脏病（CKD）如今已成为现代社会中严重威胁人类健康的一大 “隐形杀手”。在肾脏疾病的发展进程里，肾纤维化就像一个 “顽固的敌人”，几乎出现在所有 CKD 的进展阶段，是导致肾脏功能不断恶化的关键因素。目前针对 CKD 的治疗手段十分有限，患者的治疗选择少，治疗效果也不尽如人意。而肾小管上皮细胞（TECs）死亡在 CKD 的发生发展中扮演着重要角色，多种细胞死亡途径参与其中，但非凋亡形式的调节性细胞死亡如何调控肾纤维化的具体机制却一直是个未解之谜。
铁死亡作为一种非凋亡形式的调节性细胞死亡，与铁和脂质氢过氧化物的稳态失衡密切相关，其在多种疾病中都有着重要影响。此前研究发现，铁死亡与 CKD 似乎存在着千丝万缕的联系，比如 TECs 中的铁过载会加重肾纤维化进程，使用铁螯合剂治疗能改善这一情况，然而铁死亡在 CKD 中的具体作用机制依旧模糊不清。因此，深入探究铁死亡在 CKD 中的作用机制，寻找潜在的治疗靶点，成为了医学领域亟待解决的问题。
为了攻克这一难题，同济医学院的研究人员勇挑重担，开展了一系列深入且全面的研究。他们通过构建单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型和使用转化生长因子 -β（TGF-β）处理人近端肾小管上皮细胞系 HK-2 细胞，模拟体内外肾纤维化过程，来探究铁死亡与肾纤维化之间的关系。研究人员运用铁死亡抑制剂（ferrostatin-1，Fer-1）以及在体内外实现 TECs 靶向的谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）过表达，进一步研究 TECs 铁死亡对肾纤维化进展的影响及潜在机制。最终，研究发现抑制 TECs 铁死亡能够有效缓解肾间质纤维化，并且明确了铁死亡促纤维化的机制与 TGF-β/Smad 通路紧密相关。这一研究成果为 CKD 的治疗提供了全新的策略和潜在的治疗靶点，在慢性肾脏病治疗领域具有重要的意义。该研究成果发表在《Cell Death & Disease》期刊上。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，构建动物模型，通过对 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠进行单侧输尿管结扎手术，建立 UUO 小鼠模型；细胞实验方面，使用人近端肾小管上皮细胞系 HK-2 细胞进行体外培养和处理。此外，运用免疫荧光染色、Western blot 分析、定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）等技术，检测相关蛋白和基因的表达水平，从而对铁死亡和肾纤维化相关指标进行评估。
下面来详细看看具体的研究结果：
- UUO 过程中肾小管上皮细胞持续发生铁死亡：研究人员检测了 UUO 术后不同时间点（3 天、7 天和 14 天）C57BL/6 小鼠的铁死亡情况。通过免疫荧光染色检测脂质过氧化指标 4 - 羟基壬烯醛（4-HNE）和抗氧化蛋白 GPX4 的表达，发现随着时间推移，4-HNE 表达逐渐增加，GPX4 表达逐渐减少。同时，检测核心脂质代谢酶和铁代谢相关基因发现，酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4（ACSL4）蛋白水平从第 3 天开始呈时间依赖性增加，铁代谢相关基因在术后 3 天变化不明显，后期逐渐下降。这些结果表明，GPX4 对维持小鼠铁死亡过程中的正常代谢活动至关重要，其表达下调会加剧脂质过氧化和铁失衡，推动肾间质纤维化的发展。
- 药物抑制铁死亡可减轻 UUO 诱导的肾纤维化：研究人员使用铁死亡抑制剂 Fer-1 处理 UUO 小鼠，结果显示 Fer-1 显著抑制了脂质过氧化产物的积累和细胞死亡，减少了脂质代谢酶 ACSL4 和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 3（LPCAT3）的表达，同时提高了 GPX4 的表达。在肾间质纤维化方面，Fer-1 处理的小鼠肾脏形态学损伤明显减轻，纤维化标志物纤连蛋白（fibronectin）、α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和胶原蛋白 - 1（collagen-1）的表达显著降低。这表明药物有效控制铁死亡能够缓解肾纤维化进程，持续激活的 TECs 铁死亡会促进肾纤维化的发展。
- 药物抑制 TEC 铁死亡可减弱 UUO 诱导的肾纤维化中 TGF-β/Smad 信号通路的激活：由于 TECs 产生的多种促纤维化细胞因子如 TGF-β、结缔组织生长因子（CTGF）、血小板衍生生长因子亚基 b（PDGFB）和碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）是肾纤维化发展的关键调节因子。研究人员检测了 Fer-1 处理后这些因子的表达，发现 Fer-1 显著降低了 TGF-β 及其下游关键效应因子（p-Smad2、p-Smad3、CTGF、PDGFB 和 FGF2）的水平，抑制了 TGF-β/Smad 信号通路的激活，减少了促纤维化细胞因子的产生。这说明 TEC 铁死亡可能通过激活 TGF-β/Smad 信号通路和增强促纤维化细胞因子的表达来加速肾间质纤维化。
- 药物抑制铁死亡可减轻 TGF-β 处理的 HK-2 细胞的纤维化变化：在体外实验中，TGF-β 被证实可诱导 HK-2 细胞发生纤维化变化。研究人员用 TGF-β 处理 HK-2 细胞，同时添加或不添加 Fer-1。结果发现，TGF-β 诱导了脂质氢过氧化物的积累，激活了铁死亡，而 Fer-1 显著改善了这一情况，恢复了细胞功能，减少了细胞损伤。同时，Fer-1 还降低了 TGF-β 诱导的纤维化标志物（fibronectin、α-SMA 和 collagen-1）的表达。这表明抑制铁死亡能够有效缓解 TGF-β 诱导的 HK-2 细胞纤维化。
- 抑制铁死亡通过 TGF-β/Smad 信号通路减轻 TGF-β 诱导的体外促纤维化反应：研究人员进一步探究铁死亡引发体外促纤维化反应的机制，检测了 TGF-β 处理的 HK-2 细胞中促纤维化因子的变化。结果显示，TGF-β 诱导了 TGF-β、p-Smad2、p-Smad3 和促纤维化细胞因子（TGF-β、CTGF、PDGFB 和 FGF2）的高表达，而铁死亡抑制剂 Fer-1 抑制了这些因子的表达。这表明铁死亡在肾纤维化中起着关键作用，它通过维持 TGF-β/Smad 信号通路的激活和促进下游促纤维化因子的释放，最终导致纤维化的发生。
- GPX4 过表达小鼠在 UUO 过程中 TECs 铁死亡得到修复：研究人员利用腺相关病毒载体在肾近端 TECs 中过表达 GPX4（AAV9-mGPX4），结果显示，GPX4 过表达有效抑制了 UUO 诱导的 GPX4 表达下降、脂质氢过氧化物（4-HNE）积累和细胞死亡，同时降低了脂质代谢酶 ACSL4 和 LPCAT3 的水平。这表明 GPX4 过表达能够有效逆转铁死亡的进展。
- GPX4 过表达小鼠在 UUO 过程中可减轻肾间质纤维化：研究人员观察了 GPX4 过表达小鼠在 UUO 过程中的肾间质纤维化情况，发现与对照组相比，GPX4 过表达小鼠肾脏的形态学损伤明显减轻，纤维化标志物（fibronectin、α-SMA 和 collagen-1）的表达显著降低。这进一步证明了 GPX4 过表达能够保护 TECs 免受铁死亡的影响，减轻肾间质纤维化。
- 铁死亡缺陷通过 TGF-β/Smad 信号通路保护肾脏免受纤维化变化：研究人员检测了 GPX4 过表达小鼠中 TGF-β/Smad 信号通路和促纤维化细胞因子的表达，发现 GPX4 过表达显著抑制了 UUO 诱导的 TGF-β、p-Smad2 和 p-Smad3 的上调，同时降低了促纤维化细胞因子的活性。这表明抑制 TEC 铁死亡可以通过抑制 TGF-β/Smad 信号通路来保护肾脏免受纤维化变化。
- GPX4 过表达抑制 TGF-β 处理的 HK-2 细胞中铁死亡的激活：在体外实验中，研究人员建立了 GPX4 过表达的 HK-2 细胞系，并用 TGF-β 处理。结果显示，TGF-β 诱导的 HK-2 细胞铁死亡敏感性增加，而 GPX4 过表达显著抑制了这一现象，减少了脂质过氧化，恢复了细胞功能，降低了纤维化标志物的表达。这表明 GPX4 过表达能够有效改善 TGF-β 诱导的铁死亡积累和纤维化变化。
- 铁死亡缺陷通过 GPX4 过表达减轻 TGF-β 诱导的 HK-2 细胞纤维化：研究人员检测了 GPX4 过表达对 TGF-β 诱导的 HK-2 细胞纤维化标志物表达的影响，发现 GPX4 过表达显著降低了纤维化标志物（fibronectin、α-SMA 和 collagen-1）的蛋白和 mRNA 表达。这进一步证明了铁死亡缺陷能够减轻 TGF-β 处理的 HK-2 细胞的纤维化变化。
- 在 HK-2 细胞中，过表达 GPX4 抑制铁死亡可减弱 TGF-β/Smad 信号通路的激活：研究人员检测了 GPX4 过表达对 TGF-β 处理的 HK-2 细胞中 TGF-β/Smad 信号通路和促纤维化细胞因子 mRNA 表达的影响，发现 GPX4 过表达显著抑制了 TGF-β 诱导的 TGF-β、p-Smad2、p-Smad3 和促纤维化细胞因子（TGF-β、CTGF、PDGFB 和 FGF2）的表达。这表明 GPX4 过表达导致的铁死亡缺陷可能通过 TGF-β/Smad 信号通路和相关促纤维化细胞因子来调节 TGF-β 诱导的纤维化进展。
在讨论部分，研究人员指出，虽然铁死亡在肾脏疾病中的作用已有所研究，但 TECs 铁死亡驱动肾纤维化的机制仍有待进一步阐明。本研究发现，铁死亡是肾纤维化进展中的一个不良适应性过程，持续激活的铁死亡会加速肾间质纤维化。抑制铁死亡可以有效缓解 TEC 损伤和基质胶原沉积，抑制 TGF-β/Smad 信号通路，减少 TECs 释放促纤维化细胞因子。此外，研究还发现维持 GPX4 活性可能是预防肾纤维化的一种有前景的治疗策略。
综上所述，该研究明确了 TECs 铁死亡是肾纤维化疾病的关键病理机制，抑制 TECs 铁死亡通过抑制 TGF-β/Smad 信号通路，有效改善了肾间质纤维化，显著降低了促纤维化因子的表达。这一研究成果为慢性肾脏病的治疗提供了新的靶点和理论依据，有望为未来开发更有效的治疗方法奠定基础。
